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000一、PCR反应组分 1.模板DNA: 来源比较广,用于复制的PCR模板可以是任何DNA来源,如基因组DNA(gDNA)、互补DNA(cDNA)和质粒DNA。不过,DNA的组成或复杂度会影响PCR扩增的最佳起始量。例如,在起始量为50 µL 的PCR中,只需0.1–1 ng质粒DNA,而gDNA则需要5–50 ng。最佳模板起始量还取决于所使用的 DNA 聚合酶类型;经过改造 的DNA聚合酶对模板的亲和力更强,灵敏度更高,所需的DNA起始量更少。对DNA起始量的优化很重要,因为起始量过高会增加发生非特异性扩0那么,当我们遭遇支原体污染时,该如何应对呢?今天,让我们一起来探讨这个困扰。 支原体是一种直径大小仅为0.1-0.3μm,无细胞壁,可轻松透过一般过滤膜混入培养系统中的最小最简单的原核生物,呈高度多形性,有球形、杆形、丝状,分枝状等多种态。它不同于细菌,也不同于病毒,种类繁多,分布广泛,所以防不胜防! 先看下支原体污染的检测方法,以下是一些常用的检测技术: 1 DNA染色法:使用如Hoechst 33258或DAPI这类荧光染料对细胞核DNA进01 总述实时荧光定量PCR(后续简称为qPCR)顾名思义就是在PCR反应体系中加入荧光物质,通过荧光信号的实时接收监测PCR反应进程,由于其模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,以此为依据进而达到定量的目的。简单来讲,qPCR可分为荧光染料法(以SYBR GreenⅠ最常用)与荧光探针法(TaqMan 探针)两种,而其结果分析方法也有绝对定量和相对定量之分。在此不一一赘述,此次分享以SYBR GreenⅠ法为例,结果分析选用相对定量法。 2 实验设计2.1 总0苏木精-伊红染色法 ( Hematoxylin-Eosin staining ),简称HE染色法 ,切片技术里常用的染色法之一 。苏木精染液为碱性 ,主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色;伊红为酸性染料,主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。 实验步骤: 1、取样固定 取新鲜的组织样品,加入4 %多聚甲醛组织固定液的EP管中。取样材料应该小而薄,约黄豆粒大小。 2、脱水 采用梯度酒精浓度法脱水。通常选择50%-60%-70%-90%-95%-100%的浓度梯度,各酒精浓度要求准确,95%2借着我的第一篇SCI成功发表来谈谈语言润色 自己的第一篇SCI,从开始有思路到下笔到整理成文一路艰苦自不必说,关键是我原始手稿很多语病,贸然发表显然会直接悲剧。后来别人推荐,找了AJE润色我的文章,前后润色两次,AJE非常仔细的修改,具备很高的效率,例如提交的时候便提前告知我预期修改完成日期,结果提前一天完成,十分准时,而且质量超级棒,提供润色证书,可以提交给杂志社给人以重视的态度,更利于文章接受。总之感觉服务十00小伙伴们早上好,今天聊下玄学实验-Western blot,如果在实验中没有观察到阳性条带或者条带较弱,可能有多种原因导致这种情况。以下是一些可能的原因及其解决方法: 1 蛋白质表达量低:目标蛋白在样本中的表达量可能低于检测限,导致条带弱或不可见。 解决方法:使用更多的细胞或组织样本,或者增加蛋白的加载量。 2 不适当的抗体:使用的一抗或二抗可能特异性不强,或者稀释比例不当。 解决方法:验证抗体的特异性,优化抗体稀释比例。 30如果在实验中没有观察到阳性条带或者条带较弱,可能有多种原因导致这种情况。以下是一些可能的原因及其解决方法: 1 蛋白质表达量低:目标蛋白在样本中的表达量可能低于检测限,导致条带弱或不可见。 解决方法:使用更多的细胞或组织样本,或者增加蛋白的加载量。 2 不适当的抗体:使用的一抗或二抗可能特异性不强,或者稀释比例不当。 解决方法:验证抗体的特异性,优化抗体稀释比例。 3 样本处理不当:样本在裂解、煮沸或电泳过程中00一、PCR反应组分 1.模板DNA: 来源比较广,用于复制的PCR模板可以是任何DNA来源,如基因组DNA(gDNA)、互补DNA(cDNA)和质粒DNA。不过,DNA的组成或复杂度会影响PCR扩增的最佳起始量。例如,在起始量为50 µL 的PCR中,只需0.1–1 ng质粒DNA,而gDNA则需要5–50 ng。最佳模板起始量还取决于所使用的 DNA 聚合酶类型;经过改造 的DNA聚合酶对模板的亲和力更强,灵敏度更高,所需的DNA起始量更少。对DNA起始量的优化很重要,因为起始量过高会增加发生非特异性扩3000000一、大、小鼠割(剪)尾采血 当取血量较少时采用本法。采血前将鼠尾部浸在50℃左右温水中数分钟或用大功率灯泡照射数分钟,麻醉动物,使尾部血管充盈。用75%酒精擦拭鼠尾,用锋利的刀片在尾部作一横切口,割破尾静脉或动脉,让血液自由滴入盛器或用毛细吸管吸取,采血结束,伤口消毒并压迫止血。若多次取血,最好从鼠尾末端开始。小鼠每次可取血0.1ml左右,大鼠每次可取血0.3~0.5ml。若只需要几微升血量,可用锐器(刀或剪刀)垂直割去00PCR反应中的主要由引物、 4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)、Mg2+、模板和Taq DNA聚合酶五个成份组成。各个组份都能影响 PCR 结果的好坏。 1引物 PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则: (1) 引物长度约为16-30 bp, 太短会降低退火温度影响引物与模板配对,从而使非特异性增高。太长则比较浪费,且难以合成。 (2)引物中G+C含量通常为40%-60%,可按下式粗略估计引物00分子克隆实验——无缝克隆 今天和大家讲讲无缝克隆常见的问题以及解决方法。 1.平板上很少或者没有克隆菌落 建议使用试剂盒附带的阳性对照,可排除试剂盒本身的影响。进一步判定,主要有以下可能的情况和建议: 01载体制备 线性化载体和插入片段的纯度不够,抑制反应。 02插入片段制备 1、引物设计不正确:同源臂15~25nt(不计算酶切位点),CG含量40~60%。 2、线性化载体和插入片段的纯度不够,抑制反应。若线性化载体与插入片段已经过纯化,000液氮罐的定义 采用真空绝热保温技术制作的容器,放液氮于其中,利用液氮常压下沸点-196℃的原理,实现生物样本长时间低温保存的设备。 液氮罐的分类 根据液氮罐的不同指标,液氮罐有不同的分类。 按用途分 按用途分,可以分为液氮存储罐和液氮运输罐两种。其中液氮存储罐适合于不同容量长时间的稳定存储,罐体不能用来运输,运输存在安全隐患。液氮运输罐具有体积小和减震结构设计,适用于少量样本的转移存储和短距离运输使用。 按液0脾细胞是ELISpot和FluoroSpot测定中使用最多的细胞,至少对小鼠和大鼠样本而言是如此。脾细胞可以很容易地从脾脏中分离出来,而不需要Ficoll分离。细胞可以在分离后直接使用,也可以冷冻保存,并在以后批量使用。 下面是编译自https://www.mabtech.com/knowledge-hub/isolation-freezing-and-tha的关于如何最好地(i)分离、(ii)冻存和(iii)复苏脾细胞的详细指南。 脾细胞的分离 材料 细胞过滤器,70µm尼龙,无菌 无菌剪刀和镊子或镊子 无菌培养皿 巴氏移液管,无0菌种活化就是将保藏状态的菌种 放入适宜的培养基中培养 逐级扩大培养得到纯而壮的培养物 即获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物 菌种发酵有一般需要2-3代的复壮过程,因为保存时的条件往往和培养时的条件不相同,所以要活化,让菌种逐渐适应培养环境。 01、一般菌种临时存放及活化 1.低温保存管应存放于-20℃ ~ -80℃之低温条件下。 2.准备 37℃之 70﹪酒精浴槽(只能在电气水浴槽中改放酒精,不可以火加温,以免危险;若以 37℃水浴取代000本期小助手帮大家详解一个细胞实验,从鼠的脂肪细胞中分离巨噬细胞的实验,步骤多、操作繁琐,但别急,跟着小助手一步一步来做,话不多说,上干货。 实验步骤 01 分离•用PBS清洗脂肪组织,并将组织放在冰上的培养皿中,用剪刀将组织切成小块(约3-5mm)。•将切碎的组织转移到含有7ml冰冷消化缓冲液的10ml圆底管中,此操作需一直保持在冰上。对于>1g的脂肪,将组织切碎并转移到含有10ml冰冷消化缓冲液的50ml锥形管中。•加入1ml(如脂肪组0000免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术 (immunocytochemistry) 是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应,即抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原 (多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及定量的研究。它是组织化学的分支,它是用标记的特异性抗体 (或抗原) 对组织内抗原 (或抗体) 的分布进行组织和细胞原位检测技术。 一、免疫组化技术的基本原理 应用免疫学及组织0活性氧(ROS)的流式检测通常是通过使用荧光探针如DCFH-DA来监测细胞内活性氧水平的变化。以下是该检测方法的一些关键步骤和原理: 01选择荧光探针常用的荧光染料是DCFH-DA,它能够进入细胞并在细胞内被酯酶水解成DCFH。DCFH随后可以被细胞内的活性氧氧化,生成发荧光的DCF。 02DCFH-DA是一种用于检测活性氧ROS的荧光探针,全称为2,7-二氯荧光素二乙酸酯。其工作原理为:DCFH-DA本身没有荧光,但可以自由穿过细胞膜,一旦进入细胞,它会被细胞内的酯00无条带 1.蛋白表达量低:充分了解研究的蛋白,表达量低适当增加上样量,20-50μg。 2.本底表达还是诱导表达,非特异性条带。 3.样本提取蛋白使用蛋白酶抑制剂,磷酸酶抑制剂,并设置对照,避免蛋白降解。 4.检查一抗特异性是否适合目的蛋白的种属,看说明书,一抗二抗最好买经过验证的。 5.蛋白转膜效率低:可以丽春红染色检查转膜效率,分子量小的蛋白,注意用小孔茎的膜。 6.适当调整优化转膜的时间和电流。 7.分子量表达低的选择超敏的发光00研究生培养是高等教育的一项重要任务。研究生导师责任重大。导师不只是要向学生传授知识和方法,还负有传承精神、文化的重任。所谓带学生,就是和学生一起探求、开发,不是说有学问、学术地位高就能带好学生。导师要时刻牢记重任在肩,如何当好导师是大学教师的一个重要话题。今天我主要谈谈作为导师所不应做或不能做的十件事,可称之为“十戒”,作为导师应遵守的要则。 01 光当老板 上个世纪七十年代末八十年代初我读研究生的时候00外泌体是一种细胞分泌的微小膜泡,大小为30~150nm的磷脂双分子结构,可在细胞间传递物质和信号。它在机体内广泛存在,如外周血、腹水、尿液、唾液、脑脊液等各种体液中。 外泌体携带有多种蛋白质、脂类、DNA和RNA等重要信息,不仅在细胞与细胞间的物质和信息传递中起重要作用,更有望成为多种疾病的早期诊断标志物。 但外泌体所存在的体液环境复杂,在尺寸、形态和生化特性等方面又存在着较大的差异,因此如何能有效地分离出外泌体以供0000