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00蛋白酶抑制剂的作用原理是什么? 蛋白酶抑制剂(protease inhibitor)从广义上指与蛋白酶分子活性中心上的一些基团结合,使蛋白酶活力下降,甚至消失,但不使酶蛋白变性的物质。 蛋白酶抑制剂有哪些使用条件? 1. 因为各种蛋白酶对不同蛋白质的敏感性相同,因此需要调整各种蛋白酶的浓度。 2. 由于蛋白酶抑制剂在液体中的溶解度极低,应注意在缓冲液中加入蛋白酶抑制剂时应充分混匀,以减少蛋白酶抑制剂的沉淀。 常用的蛋白酶抑制剂有哪些?000000000000000RT-PCR的过程确实以RNA为模板进行扩增,但这个过程包括两个主要步骤: 逆转录:使用逆转录酶(Reverse Transcriptase, RT)将RNA模板逆转录成cDNA。逆转录酶能够利用RNA为模板合成与之互补的DNA链。 PCR扩增:逆转录得到的cDNA作为模板,随后进行PCR扩增。在PCR过程中,DNA聚合酶用来合成大量的DNA拷贝,这一步骤是针对cDNA而不是原始RNA模板进行的。 为什么不以RNA为模板进行扩增呢? 1 PCR技术依赖于DNA聚合酶,而这种酶只能催化DNA链的合成,不能直接使用RNA作0实验步骤: 一、细胞复苏 1.从液氮中取出保存的细胞,放入一次性手套于37℃水浴锅中摇晃快速溶解,大约1 min; 2.1000 rpm离心5 min; 3.吸出冻存液,加入相应的细胞培养液重悬细胞; 4.然后转移到培养瓶中,添加足量的培养液; 5.放入5%CO2、37℃培养箱中培养,隔天更换新的培养液。 注意事项:1.从液氮罐中取出细胞时,应做好个人防护以免冻伤;2.冻存细胞取出后,如不能立即放入水浴锅中融化,需将其放在干冰上保存转移;3.细胞水浴解冻时间以1min0在细胞培养的过程中支原体污染是一个让人头疼的问题。它如同一个“不速之客”,悄然潜入细胞培养体系,给我们的实验带来诸多困扰。你是否有过这样的经历,培养的细胞无声无息地就被毁掉了?实验数据很难重复? 那么,当我们遭遇支原体污染时,该如何应对呢?今天,让我们一起来探讨这个困扰。 支原体是一种直径大小仅为0.1-0.3μm,无细胞壁,可轻松透过一般过滤膜混入培养系统中的最小最简单的原核生物,呈高度多形性,有球形、杆形、0001 什么是PCR? PCR(聚合酶链式反应)是一种分子生物学中用于快速复制大量特定DNA片段的技术。它由Kary Mullis在1983年发明,因此他获得了1993年的诺贝尔化学奖。PCR的基本步骤包括三个主要阶段:变性、退火和延伸,这些步骤在一个循环过程中重复进行,以指数方式增加目标DNA的数量。 1 变性(Denaturation):在这个阶段,双链DNA被加热至高温(通常是94°C至98°C),导致氢键断裂,使得DNA双链分离成两条单链。2 退火(Annealing):随后,温度降低至50°C至0000在实验室工作中,转膜是一个非常重要的步骤。那么,转膜技巧的关键你知道是什么吗? 首先,选择合适的膜是关键之一。不同的膜具有不同的特点,需要根据实验的具体需求进行选择。转移分子量小于20kDa的蛋白时建议使用小孔径的膜 (如0.22μm),正常情况下使用0.45μm孔径的膜即可。 其次,正确的缓冲液配制也至关重要。它会影响到蛋白的转移效果。转膜过程会伴随严重的发热现象,建议提前配好缓冲液并在4 ℃冰箱进行预冷。建议在4 ℃条件下进000000000000000流动相是影响液相色谱的关键因素。一个理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度、与检测器兼容性好、易于得到纯品和低毒性等特征。高效液相色谱法中的流动相主要用水性溶剂、有机溶剂或它们的混合液,但是如何配制。选择配制的方法不同,分析结果特别是保留时间,是会有显著差别的。高效液相色谱法中的流动相主要用水性溶剂、有机溶剂或它们的混合液,水性溶剂也常用于缓冲液。常因资料上表示的内容和实际的配制方法不同,而产生流动0免疫荧光染色是实验室常用的技术之一,但在操作过程中,有许多需要注意的细节,任何一个环节的失误都可能导致实验失败。本文将为您介绍免疫荧光染色的注意事项,并附上零失误封片技巧。 1. 抗体选择:选择针对您研究的目标蛋白特异性高、亲和力强的抗体,一抗的浓度需要预实验摸索。一抗浓度过高(本身荧光实验,一抗的浓度就较高),也是造成自发荧光强的重要原因。 2. 抗体稀释:根据抗体说明书建议,使用合适的稀释液和稀释比例进行000001 总述实时荧光定量PCR(后续简称为qPCR)顾名思义就是在PCR反应体系中加入荧光物质,通过荧光信号的实时接收监测PCR反应进程,由于其模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,以此为依据进而达到定量的目的。 简单来讲,qPCR可分为荧光染料法(以SYBR GreenⅠ最常用)与荧光探针法(TaqMan 探针)两种,而其结果分析方法也有绝对定量和相对定量之分。在此不一一赘述,此次分享以SYBR GreenⅠ法为例,结果分析选用相对定量法。 2 实验设计2.1 总0活性氧(ROS)的流式检测通常是通过使用荧光探针如DCFH-DA来监测细胞内活性氧水平的变化。以下是该检测方法的一些关键步骤和原理: 01选择荧光探针常用的荧光染料是DCFH-DA,它能够进入细胞并在细胞内被酯酶水解成DCFH。DCFH随后可以被细胞内的活性氧氧化,生成发荧光的DCF。 02DCFH-DA是一种用于检测活性氧ROS的荧光探针,全称为2,7-二氯荧光素二乙酸酯。其工作原理为:DCFH-DA本身没有荧光,但可以自由穿过细胞膜,一旦进入细胞,它会被细胞内的酯0缓冲溶液(Buffer solution)通常是由「弱酸及其共轭碱」或「弱碱及其共轭酸」缓冲对所组成的溶液,能够在加入一定量其他物质时减缓pH的改变。 1 常见缓冲溶液类型 常用作缓冲溶液的酸类由弱酸及其共轭酸盐组合成的溶液具有缓冲作用。常见的缓冲体系有: (1)弱酸和它的盐(如HAc—NaAc) (2)弱碱和它的盐(NH3·H2O—NH4Cl) (3)多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐(如NaH2PO4—Na2HPO4)的水溶液组成。 2 缓冲溶液的选择 为了保证缓冲液有足够强的缓冲能力,