基质辅助激光解吸/电离（MALDI）成像质谱（IMS）是一项强大的技术，可通过一次实验研究整个组织切片中数千个分子的空间分布。由于蛋白质代表组织和细胞中重要的功能分子组，因此蛋白质成像已成为IMS技术和方法发展的重点。蛋白质谱鉴定对于分子成像数据的生物学环境至关重要。然而，MALDI产生的蛋白质的气相碎裂效率，使得直接从组织中进行蛋白鉴定变得困难。MALDI成像质谱系列文章重点介绍与蛋白质谱鉴定相关的方法和技术，这些方法可以用于克服MALDI IMS实验中蛋白质谱鉴定遇到的挑战。
自1990年代后期引入基质辅助激光解吸/电离成像质谱仪（MALDI IMS）以来，该技术的实用性得到了迅速的增长，MALDI IMS被用于分析从植物，昆虫到哺乳动物等生物样本的蛋白质谱鉴定。MALDI IMS可以对样品表面的数千种物质进行无标记的多重分析，生成二维分子图，实现对内源性物质的定位及丰度测定。MALDI IMS已用于多种物质的研究，包括代谢物，药物，脂质，肽和蛋白质。由于蛋白质在细胞过程中扮演的角色，而 MALDI IMS允许在单个成像实验中可视化蛋白质及其各种蛋白形式（即不同的翻译后修饰），因此蛋白质成像技术引发了广泛关注。如下图中所示，首先使用MALDI基质将整个组织切片进行覆盖，该基质有助于在激光辐照期间内源性生物分子的解吸和电离从而实现MALDI IMS。然后，在离散的x，y坐标处收集各个质谱图，以便在整个样品区域上绘制信号强度图，从而创建离子图像。单个MALDI IMS实验可产生数千个离子图像，从而为经典组织学分析提供了分子生物学基础。碎片化的数据信息通过独立的实验收集，可以直接从组织中收集，也可以在提取后通过LC-MS /MS进行收集。
图注：蛋白质成像的MALDI IMS工作流程概述。（a）将组织样品切成薄片，洗涤以除去干扰盐和脂质，并用MALDI基质均匀包被。样品制备后，将样品加载到仪器中，然后用激光照射该部分，并移动定义的横向距离，该距离决定了图像的空间分辨率。（b）在每个像素位置产生质谱图谱。（c）在采样的组织区域内的坐标系中绘制选定质量范围的离子强度，以创建离子图像。（d）在IMS实验之后或与之并行进行的正交实验是为了获取可以与成像数据相关的蛋白质鉴定数据。
MALDI IMS中的蛋白质鉴定对于帮助理解生物分子和细胞系统的生理作用至关重要。但是，MALDI产生的离子通常处于低电荷状态，大大降低了它们的气相碎裂效率，从而限制了序列覆盖范围，因此想要实现对许多成像实验中观察到的蛋白质进行鉴定还充满了挑战。质谱分析中的蛋白质谱鉴定常使用自下而上或自上而下的方法。自下而上的蛋白质鉴定方法依靠酶消化将较大的蛋白质水解为更易于片段化的较小肽，从而获得更高的序列覆盖率。在自上而下的方法中，将完整的蛋白质注入质谱仪中并进行片段化，无需事先消化。除了更好地跟踪蛋白质修饰之外，自上而下的蛋白质鉴定优势在于，它可以通过对完整蛋白质的质量进行测量来对成像进行补充，该完整蛋白质与MALDI IMS产生的信号更直接相关。
对于自下而上和自上而下的蛋白质组学实验，通常使用碰撞诱导解离（CID）或电子转移解离（ETD）来使蛋白质和肽片段化。在CID中，离子被加速并与中性气体碰撞，从而导致离子的内部能量增加。如果沉积的能量超过键的临界能量，则会发生断裂。“移动质子模型”用于描述CID研究中蛋白质和多肽的解离。该模型假设高电荷蛋白质的序列片段是由质子动员到肽主链上的羰基后的电荷定向断裂产生的。但是，MALDI主要产生带有少量质子的低电荷态离子，这些离子倾向于被隔离在高碱性氨基酸侧链上（例如Lys和Arg）。因此，MALDI产生的蛋白质离子片段具有较差的序列覆盖率。在ETD中，离子会在离子阱中被自由基阴离子轰击，从而导致电子转移并形成自由基阳离子。一旦形成自由基阳离子，沿肽主链发生快速解离，产生信息序列片段。ETD要求存在多个质子，并且给定蛋白或肽的片段化效率与电荷状态的增加高度相关。由于这些原因，ETD对MALDI产生的蛋白质的适用性也受到限制。
为了克服这些问题，实现对MALDI生成的蛋白质进行蛋白质谱鉴定的一些新的方法和技术也应用到基于MALDI IMS蛋白质谱鉴定。这些方法和技术通过在MALDI图像分析后或使用一系列组织切片的方式进行。比较常见的方式是，通过从组织中提取蛋白质，结合电喷雾电离（ESI）对样品进行分析。ESI能够产生高电荷的离子，这些高电荷的离子更适合CID和ETD裂解。通过这些补充方法，可以使用更传统的蛋白质组学工作流程进行蛋白质鉴定，并且可以通过精确的质量匹配将所得鉴定与成像数据相关联。
MALDI IMS仪器和样品制备方法的发展使常规成像技术可以对组织中的肽和蛋白质进行成像。为了充分阐明这些图像所代表的基本生物学特性，可以采用鉴定来自IMS实验的蛋白质信号的方法。正交、空间靶向的蛋白质组学技术和方法的发展使得肽和蛋白质的识别更加可信，推动了蛋白质IMS技术在下一代生物应用中进一步的使用。该领域的重点是结合技术以在更高的空间分辨率下最大限度地提高灵敏度和破碎效率。例如，仪器源可以更好地控制源压力，可以提高高性能成像平台上完整蛋白分析的灵敏度。采用电荷状态无关的离子活化技术（例如紫外光解离）使MALDI直接从组织中对完整蛋白质进行空间靶向碎片化，能够可视化蛋白质组并最终更深入地了解病理相关过程的方法。通过提供在完整组织中发现的动态分子相互作用和蛋白质网络的空间环境，这将开创系统生物学的新纪元，为探索疾病扰动的系统和药物靶标发现提供了新的可能性。
本文由北京百泰派克生物科技编辑整理，资料来源：
Ryan, 2019, Protein identification strategies in MALDI imaging mass spectrometry: a brief review
北京百泰派克生物科技有限公司从事蛋白质理化性质分析及结构解析、以质谱技术为基础的蛋白质组学代谢组学技术服务。公司致力于建立国际领先的蛋白质研究分析技术平台，为各科研院所和大学提供高效、准确、性价比高的蛋白质（组）研究技术包裹，协助客户在基础研究、分子诊断及其他生命科学研究领域取得突破，为生命科学的发展做出贡献。
自1990年代后期引入基质辅助激光解吸/电离成像质谱仪（MALDI IMS）以来，该技术的实用性得到了迅速的增长，MALDI IMS被用于分析从植物，昆虫到哺乳动物等生物样本的蛋白质谱鉴定。MALDI IMS可以对样品表面的数千种物质进行无标记的多重分析，生成二维分子图，实现对内源性物质的定位及丰度测定。MALDI IMS已用于多种物质的研究，包括代谢物，药物，脂质，肽和蛋白质。由于蛋白质在细胞过程中扮演的角色，而 MALDI IMS允许在单个成像实验中可视化蛋白质及其各种蛋白形式（即不同的翻译后修饰），因此蛋白质成像技术引发了广泛关注。如下图中所示，首先使用MALDI基质将整个组织切片进行覆盖，该基质有助于在激光辐照期间内源性生物分子的解吸和电离从而实现MALDI IMS。然后，在离散的x，y坐标处收集各个质谱图，以便在整个样品区域上绘制信号强度图，从而创建离子图像。单个MALDI IMS实验可产生数千个离子图像，从而为经典组织学分析提供了分子生物学基础。碎片化的数据信息通过独立的实验收集，可以直接从组织中收集，也可以在提取后通过LC-MS /MS进行收集。
图注：蛋白质成像的MALDI IMS工作流程概述。（a）将组织样品切成薄片，洗涤以除去干扰盐和脂质，并用MALDI基质均匀包被。样品制备后，将样品加载到仪器中，然后用激光照射该部分，并移动定义的横向距离，该距离决定了图像的空间分辨率。（b）在每个像素位置产生质谱图谱。（c）在采样的组织区域内的坐标系中绘制选定质量范围的离子强度，以创建离子图像。（d）在IMS实验之后或与之并行进行的正交实验是为了获取可以与成像数据相关的蛋白质鉴定数据。
MALDI IMS中的蛋白质鉴定对于帮助理解生物分子和细胞系统的生理作用至关重要。但是，MALDI产生的离子通常处于低电荷状态，大大降低了它们的气相碎裂效率，从而限制了序列覆盖范围，因此想要实现对许多成像实验中观察到的蛋白质进行鉴定还充满了挑战。质谱分析中的蛋白质谱鉴定常使用自下而上或自上而下的方法。自下而上的蛋白质鉴定方法依靠酶消化将较大的蛋白质水解为更易于片段化的较小肽，从而获得更高的序列覆盖率。在自上而下的方法中，将完整的蛋白质注入质谱仪中并进行片段化，无需事先消化。除了更好地跟踪蛋白质修饰之外，自上而下的蛋白质鉴定优势在于，它可以通过对完整蛋白质的质量进行测量来对成像进行补充，该完整蛋白质与MALDI IMS产生的信号更直接相关。
对于自下而上和自上而下的蛋白质组学实验，通常使用碰撞诱导解离（CID）或电子转移解离（ETD）来使蛋白质和肽片段化。在CID中，离子被加速并与中性气体碰撞，从而导致离子的内部能量增加。如果沉积的能量超过键的临界能量，则会发生断裂。“移动质子模型”用于描述CID研究中蛋白质和多肽的解离。该模型假设高电荷蛋白质的序列片段是由质子动员到肽主链上的羰基后的电荷定向断裂产生的。但是，MALDI主要产生带有少量质子的低电荷态离子，这些离子倾向于被隔离在高碱性氨基酸侧链上（例如Lys和Arg）。因此，MALDI产生的蛋白质离子片段具有较差的序列覆盖率。在ETD中，离子会在离子阱中被自由基阴离子轰击，从而导致电子转移并形成自由基阳离子。一旦形成自由基阳离子，沿肽主链发生快速解离，产生信息序列片段。ETD要求存在多个质子，并且给定蛋白或肽的片段化效率与电荷状态的增加高度相关。由于这些原因，ETD对MALDI产生的蛋白质的适用性也受到限制。
为了克服这些问题，实现对MALDI生成的蛋白质进行蛋白质谱鉴定的一些新的方法和技术也应用到基于MALDI IMS蛋白质谱鉴定。这些方法和技术通过在MALDI图像分析后或使用一系列组织切片的方式进行。比较常见的方式是，通过从组织中提取蛋白质，结合电喷雾电离（ESI）对样品进行分析。ESI能够产生高电荷的离子，这些高电荷的离子更适合CID和ETD裂解。通过这些补充方法，可以使用更传统的蛋白质组学工作流程进行蛋白质鉴定，并且可以通过精确的质量匹配将所得鉴定与成像数据相关联。
MALDI IMS仪器和样品制备方法的发展使常规成像技术可以对组织中的肽和蛋白质进行成像。为了充分阐明这些图像所代表的基本生物学特性，可以采用鉴定来自IMS实验的蛋白质信号的方法。正交、空间靶向的蛋白质组学技术和方法的发展使得肽和蛋白质的识别更加可信，推动了蛋白质IMS技术在下一代生物应用中进一步的使用。该领域的重点是结合技术以在更高的空间分辨率下最大限度地提高灵敏度和破碎效率。例如，仪器源可以更好地控制源压力，可以提高高性能成像平台上完整蛋白分析的灵敏度。采用电荷状态无关的离子活化技术（例如紫外光解离）使MALDI直接从组织中对完整蛋白质进行空间靶向碎片化，能够可视化蛋白质组并最终更深入地了解病理相关过程的方法。通过提供在完整组织中发现的动态分子相互作用和蛋白质网络的空间环境，这将开创系统生物学的新纪元，为探索疾病扰动的系统和药物靶标发现提供了新的可能性。
本文由北京百泰派克生物科技编辑整理，资料来源：
Ryan, 2019, Protein identification strategies in MALDI imaging mass spectrometry: a brief review
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