二维凝胶电泳（2D PAGE）分离方法可以说已经成为蛋白质组学的代名词了，是目前解决高度复杂蛋白质混合物的最有效方法之一。2D PAGE实际上是两种不同分离类型的组合。在第一种情况下，等电聚焦电泳（IEF）根据等电点分解蛋白质；在第二种情况下，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进一步分解聚焦蛋白质（如图1）。因此，2D PAGE通过等电点和分子量分别在第一维和第二维分解蛋白质。

图1. 2D-SDS-PAGE示意图
尽管2D PAGE是解决复杂蛋白质混合物的最有效方法，但自从20世纪70年代初首次引入后，它在许多年内都没有得到广泛应用，主要有两个原因：（1）实施等电聚焦技术有一定难度；（2）将聚焦的蛋白质放入SDS PAGE凝胶中也存在困难。在最初的版本中，IEF步骤依赖于“管状凝胶”，这个装置很难设置并执行。此外，管状凝胶中的pH梯度很难再现，获得含有聚焦蛋白质的精细管凝胶以有效地转移SDS PAGE平板凝胶中的蛋白质也是一项很有挑战的技术。因此，2D PAGE很难进行，重复进行更难。
随着新的2D PAGE专用系统的引入，这种情况有了很大的改善。该系统使用固定的pH梯度（IPG）条带和相对简单的硬件来促使蛋白质从IPG条带转移到SDS-PAGE平板凝胶中。IPG条带以固定的pH梯度为基础，其中多羧酸两性聚合物被固定在载体上，可重现性地产生稳定的pH梯度。现在已经可以从各大供应商处获得IPG条带，他们可以在各种或宽或窄的pH范围内提供可重复的分离。使用较窄的pH范围有助于分离等电点高度相似的蛋白质。用缓冲液将该条带水和，在电压作用下将蛋白质缓慢加载到条带中，然后增加电压以实现聚焦。商用系统提供温度控制以及高精度的电压或电流控制，以促进可重复分离。
在聚焦之后，用含有硫醇还原剂和SDS的缓冲液处理条带，然后连接到SDS-PAGE平板凝胶上。在这方面，含有聚焦蛋白的IPG条带在1D-SDS-PAGE中充当“堆积”凝胶。然后在SDS-PAGE平板凝胶上以与1D SDS PAGE相同的方式分解蛋白质。
二维凝胶分离的蛋白质通过包括银染法、考马斯亮蓝染色法和氨基黑染色法在内的常规染色技术实现可视化。其中，银染法和荧光染色法是最灵敏的。尽管这些染色技术都有许多不同的方法，但并不是所有的方法都能与随后的蛋白质分析相兼容。例如，用福尔马林固定蛋白质的银染法往往会将蛋白质固定在凝胶中，从而阻止蛋白质的消化和所有生成的肽的复原。类似的问题还源于凝胶长期暴露于醋酸中。因此，使用与随后的消化和洗脱步骤相兼容的染色方法至关重要。
在聚焦步骤之后，用含有硫醇还原剂和SDS的缓冲液处理条带，然后连接到SDS-PAGE平板凝胶。在这方面，含有聚焦蛋白的IPG条带在ID-SDS-PAGE中充当“堆积”凝胶。然后在SDS-PAGE平板凝胶上以与ID-SDS-PAGE相同的方式分解蛋白质。
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