cfDNA抽提，对血浆分离有什么要求？全血中血浆和血清均能分离出cfDNA，但研究显示，相对于血清标本，血浆中cfDNA有更高的检出率，所以临床一般建议分离出血浆进行cfDNA的抽提。血浆量越多所提取的DNA量就越多，其中含有的cfDNA量就越多，对检测越有利，所以临床一般建议采集10ml全血（4~5ml血浆），采集完成后需温柔颠倒混匀，以便于抗凝剂或保护剂充分与血液接触。根据检测的时效性，分离血浆一般有两种采集管的选择方案：一、EDTA抗凝管：用常规EDTA抗凝管采集全血后，为防止游离DNA的降解，避免野生型DNA背景的增加，建议两小时内以足够的离心力将全血充分低温离心两次，分离出不含细胞成分的血浆（离心前临时保存应暂放于2~8℃冷藏，离心也建议4度离心）。一般建议4度保存，离心，这样不容易溶血。室温（37℃）可能会使血液里的微量成分降解及溶血，其次室温（37℃）高速离心时，旋转会变热，使得酶之类对温度敏感的成分失效破坏。如果条件不允许，没有4℃离心机，短时间内（2h内）室温离心也是可以的。二、Streck采血管：一般条件允许（资金充裕）可以使用Streck管，毕竟进口的，质量还是有所保障的；如果条件不允许（资金不足），使用含有游离DNA保护剂及防细胞裂解保护剂的国产专用常温采血管。采集后轻摇混匀，常温（6~37℃）放置不超过3-7天，以足够的离心力将全血充分离心两次，分离出不含细胞成分的血浆，常温离心就可以。血浆分离的步骤不管是用EDTA采血管还是Streck采血管，采集满10ml全血后，分离的步骤都是一样的（离心温度可能有差异，影响不是很大）。首先，1600g 离心10分钟，离心结束后轻缓地将采血管取出，参照下图，若出现严重溶血和脂血，则不建议进行后续实验；如发生严重溶血，标本不可用，血红蛋白及其代谢产物可能抑制Taq酶活性，使PCR扩增效率明显降低血脂过高，使血浆呈乳白色，低密度脂蛋白对荧光有屏蔽和吸收作用，故对PCR有干扰其次，将上清血浆转移至准备好的2 mL灭菌离心管中，避免吸取过程中吸到白膜层。把装有血浆的2mL离心管进行第二次离心，16000 × g 离心10 min；最后，把离心后的上清液转移到新的2 mL灭菌离心管中，注意不要吸到沉淀，2 mL灭菌离心管中血浆量不能超过2/3，因为冷冻保存时候体积变大，导致管盖打开或者管子破碎。Tips：cfDNA量很少，大约每一毫升的血浆当中，只有十几ng（ng，10^-9）的cfDNA。每一个正常人体细胞，大约含有3.3皮克（pg，10^-12）的基因组DNA，简言之，1ng的基因组DNA，相当于300个细胞的DNA量。10毫升全血，一般可以分离到约4~5ml血浆，大约可以抽提到约 40ng~50ng 的cfDNA。40ng的cfDNA，相当于来自12000个细胞的基因组DNA。如果针对于晚期转移患者，一般cfDNA也可能达到ug级别（ug，10^-6）。cfDNA抽提，为什么更推荐Streck Cell-Free DNA采血管？市场上，一般抽提cfDNA时候都会使用Vangenes Cell-Free DNA采血管和Streck Cell-Free DNA采血管，但是两者影响其实蛮大的，也有些公司为了降低成本使用Vangenes Cell-Free DNA采血管反而适得其反，那么Streck Cell-Free DNA采血管到底有什么用呢？Streck Cell-Free DNA管是一种直接抽取全血的，可用于无细胞血浆DNA采集，稳定存储和运输的试管，（想要了解更多产品，请跳转Streck中国官网http://streck.genomeprecision.com查看）可稳定保存有核细胞基因组DNA，在无细胞DNA的分析过程中，样品的处理、运输和加工过程极易受染，导致有核血细胞分解，进一步释放细胞基因组DNA，同时，因核酸酶活性尔产生的无细胞NDA降解也会带来系列问题，Streck无创管中所含的防腐剂能稳定有核细胞，防止释放细胞基因组DNA，抑制无细胞DNA的核酸酶介导降解，有助于无细胞DNA样本保存的稳定。