第一步，ENO1存在O-糖基化修饰
越来越多的证据表明，O-糖基化会影响几种关键代谢酶的活性，从而调节细胞代谢。为了确定ENO1是否被O-糖基化修饰，化学酶标记实验发现OGA（O-连接的N-乙酰葡糖胺水解酶（O-GlcNAcase，OGA）是生物体内唯一水解蛋白质O-糖基修饰的糖苷酶。）抑制剂TMG或O-GlcNAc转移酶（OGT）过表达的情况下，O-糖基化信号显著升高（图1a）。随后用质量标记方法分析ENO1的O-糖基化水平，5kDa的PEG分子与叠氮标记的糖蛋白结合，导致WB信号的分子移位。通过量化移位带和未移位带之间的强度之比，发现正常条件下，内源性ENO1的修饰率约为27%（图1b）。在不同浓度的葡萄糖、谷氨酰胺或血清时，ENO1 O-糖基化水平呈剂量依赖性增加（图1c-e）。
第二步，鉴定ENO1上的O-糖基化位点
共表达HA-OGT和Flag-ENO1后，anti-Flag IP-MS质谱分析发现ENO1上鉴定到4个O-糖基化位点（T19、T26、S27和S249）。分别构建T19A、T26A、S27A和S249A突变体进行化学酶标记实验，T19A和S249A突变体显著降低了O-糖基化信号。双位点突变（T19A/S249A）使糖基化信号减少了约80%，表明T19和S249是ENO1上主要的糖基化位点（图1f-g）。此外，不同物种之间的序列比较表明，T19和S249都是进化保守的（图1h）。
第三步，ENO1 T19上的O-糖基化影响其酶活
ENO1敲除后外源表达WT、T19A或S249A ENO1发现，T19A突变体，而不是S249A突变体，表现出显著的活性降低（图1i），使用TMG或过表达OGT处理同样增加了WT和S249A ENO1的活性，但对T19A突变体没有明显影响（图1i）。另外，在大肠杆菌中共表达OGT和UDP-GlcNAc合成途径中的关键酶，进一步验证了该结果（图1j）。表明ENO1 T19上的O-糖基化影响其酶活。
第四步，T19 O-糖基化促进形成ENO1二聚体增加ENO1活性
T19糖基化如何调控ENO1的活性？酶动力学研究发现，在OGT过表达的情况下，WT和S249A ENO1产生2-p-甘油的最大速度（Vmax）都比T19A ENO1高得多（图1k）。随后研究T19糖基化是否会影响ENO1的低聚物化状态。Co-IP实验发现T19A ENO1破坏ENO1之间的结合；TMG处理则增强WT之间的互作，但没有增强T19A ENO1之间的互作（图1l）。另外，使用水溶性交联剂BS3（可与蛋白质上的伯胺（-NH2）反应，以稳定ENO1的寡聚化状态）处理，发现O-糖基化增加了WT ENO1二聚体蛋白的数量，但对T19A突变体没有明显影响（图1m）。表明T19 O-糖基化通过促进ENO1活性二聚体的形成来促进ENO1活性。
图1 确定ENO1的O-糖基化修饰2个位点T19/S249，其中T19 O-糖基化影响其活性（Ref. Fig 2/S2）
全文分享：《PNAS》解读：糖基化修饰影响酶活和蛋白互作！烯醇化酶1的O-糖基化在结直肠癌中作为有氧糖酵解和免疫逃避的双重调节因子如有相关科研问题，欢迎留言探讨。
越来越多的证据表明，O-糖基化会影响几种关键代谢酶的活性，从而调节细胞代谢。为了确定ENO1是否被O-糖基化修饰，化学酶标记实验发现OGA（O-连接的N-乙酰葡糖胺水解酶（O-GlcNAcase，OGA）是生物体内唯一水解蛋白质O-糖基修饰的糖苷酶。）抑制剂TMG或O-GlcNAc转移酶（OGT）过表达的情况下，O-糖基化信号显著升高（图1a）。随后用质量标记方法分析ENO1的O-糖基化水平，5kDa的PEG分子与叠氮标记的糖蛋白结合，导致WB信号的分子移位。通过量化移位带和未移位带之间的强度之比，发现正常条件下，内源性ENO1的修饰率约为27%（图1b）。在不同浓度的葡萄糖、谷氨酰胺或血清时，ENO1 O-糖基化水平呈剂量依赖性增加（图1c-e）。
第二步，鉴定ENO1上的O-糖基化位点
共表达HA-OGT和Flag-ENO1后，anti-Flag IP-MS质谱分析发现ENO1上鉴定到4个O-糖基化位点（T19、T26、S27和S249）。分别构建T19A、T26A、S27A和S249A突变体进行化学酶标记实验，T19A和S249A突变体显著降低了O-糖基化信号。双位点突变（T19A/S249A）使糖基化信号减少了约80%，表明T19和S249是ENO1上主要的糖基化位点（图1f-g）。此外，不同物种之间的序列比较表明，T19和S249都是进化保守的（图1h）。
第三步，ENO1 T19上的O-糖基化影响其酶活
ENO1敲除后外源表达WT、T19A或S249A ENO1发现，T19A突变体，而不是S249A突变体，表现出显著的活性降低（图1i），使用TMG或过表达OGT处理同样增加了WT和S249A ENO1的活性，但对T19A突变体没有明显影响（图1i）。另外，在大肠杆菌中共表达OGT和UDP-GlcNAc合成途径中的关键酶，进一步验证了该结果（图1j）。表明ENO1 T19上的O-糖基化影响其酶活。
第四步，T19 O-糖基化促进形成ENO1二聚体增加ENO1活性
T19糖基化如何调控ENO1的活性？酶动力学研究发现，在OGT过表达的情况下，WT和S249A ENO1产生2-p-甘油的最大速度（Vmax）都比T19A ENO1高得多（图1k）。随后研究T19糖基化是否会影响ENO1的低聚物化状态。Co-IP实验发现T19A ENO1破坏ENO1之间的结合；TMG处理则增强WT之间的互作，但没有增强T19A ENO1之间的互作（图1l）。另外，使用水溶性交联剂BS3（可与蛋白质上的伯胺（-NH2）反应，以稳定ENO1的寡聚化状态）处理，发现O-糖基化增加了WT ENO1二聚体蛋白的数量，但对T19A突变体没有明显影响（图1m）。表明T19 O-糖基化通过促进ENO1活性二聚体的形成来促进ENO1活性。
图1 确定ENO1的O-糖基化修饰2个位点T19/S249，其中T19 O-糖基化影响其活性（Ref. Fig 2/S2）
全文分享：《PNAS》解读：糖基化修饰影响酶活和蛋白互作！烯醇化酶1的O-糖基化在结直肠癌中作为有氧糖酵解和免疫逃避的双重调节因子如有相关科研问题，欢迎留言探讨。
