结直肠癌（CRC）的发病机制是多方面的，涉及控制肠上皮细胞增殖、凋亡和存活的多种细胞信号通路的失调。Notch1在癌症发展中发挥多种作用，目前尚不清楚是否存在能够使裂解的Notch1跨膜/细胞内区（NTM）去磷酸化以调节其功能的磷酸酶。双特异性蛋白磷酸酶（DUSPs，也称为MAPK磷酸酶）DUSP6是否参与和调节功能尚不清楚。
2024年11月，新加坡国立大学团队在Nat Commun.（IF=14.7）上发表了题为“DUSP6 regulates Notch1 signalling in colorectal cancer”的研究成果。发现DUSP6是一种Notch1磷酸酶，揭示了Notch1在癌症中的调控和功能，并为靶向Notch1信号开发人类疾病治疗提供了新的途径。
Highlights如下：
1）肿瘤中DUSP6高表达与较差的CRC患者总生存率相关；
2）DUSP6促进细胞生长和迁移；
3）小鼠中DUSP6的缺失导致结肠肿瘤发展减少；
4）机制上，DUSP6使Notch1 phospho-Y2116去磷酸化，从而降低NTM泛素化，从而提高NTM的稳定性和转录活性，促进肿瘤细胞生长。
备注：Notch1在癌症中的激活是通过Notch1细胞内结构域的磷酸化来调节的。Notch1的激活是通过结合其配体，δ样蛋白1和3，或Jagged 1和2来启动的。随后经蛋白水解裂解，释放Notch细胞内结构域（NICD）， NICD易位到细胞核中转录增殖相关基因，如c-Myc。NICD的磷酸化调控其稳定性，是决定其生物活性的关键过程。虽然已知裂解的NICD通过相应的激酶磷酸化可以调节生物活性，但磷酸酶的调节仍未被探索。NTM：Notch1跨膜/细胞内区。
临床相关性：肿瘤中DUSP6高表达与与高NICD水平和较差的CRC患者总生存率相关。
功能研究：DUSP6表达升高导致CRC细胞体外和体内增殖增强，小鼠中DUSP6的缺失导致结肠肿瘤发展减少。
机制研究：（1）DUSP6抑制MAPKs的激活，增加Notch1 NTM的水平
第一步，DUSP6抑制MAPKs的激活
DUSP6已被证明主要靶向ERK1/2。WB检测显示，过表达DUSP6导致ERK1/2、p38和JNK的激活降低，敲除DUSP6则增加其激活（图1a）。另外，过表达DUSP6增加了增殖相关基因COX2和c-MYC的表达，DUSP6的缺失则相反（图1a-1b）。
第二步，DUSP6增加Notch1 NTM的水平
据报道Notch1与CRC患者预后较差相关。Notch1作为一种跨膜受体蛋白，其激活需要γ-分泌酶对其进行蛋白水解裂解，释放被裂解的Notch1细胞内区域，用于靶标增殖相关基因的转录激活或与其他细胞因子的合作。Notch1切割量的变化会对细胞增殖产生积极影响。DUSP6的过表达导致NTM（Notch1一个短的细胞外近膜肽和一个分子量为120 kDa的跨膜序列）水平升高，而敲除DUSP6导致NTM水平降低（图1c）。表明DUSP6的表达与NTM水平呈正相关。
图1 DUSP6抑制MAPKs的激活，增加Notch1 NTM的水平（Ref. Fig 2/S4）
（2）DUSP6抑制泛素介导的NICD蛋白酶体降解
被切割的Notch1细胞内区域作为转录激活因子，激活参与肿瘤发育的各种基因。切割的Notch1细胞内区域活性可以通过磷酸化来调节，以标记泛素介导的蛋白酶体降解。然而，没有报道任何负调节因子可以使Notch1细胞内区域去磷酸化，从而保持其细胞活性/丰度。DUSP6与NTM水平的相关性提示DUSP6可能调控NTM。
第一步，DUSP6与NTM结合Co-IP实验显示内源性NTM可与细胞中flag-DUSP6结合；同时，内源性DUSP6可与HA-NTM结合（图2a-b）。表明DUSP6与NTM结合。
第二步，DUSP6能够直接使NTM去磷酸化体外去磷酸化实验发现，与DUSP6孵育后，NTM上总磷酪氨酸的数量减少了约55%（图2c）。同样，DUSP6能够使内源性NTM去磷酸化（图2d-e）。表明DUSP6能够直接使NTM去磷酸化。
第三步，DUSP6对NTM的去磷酸化可以降低NTM的泛素化
接下来，进行连续的去磷酸化和泛素化实验，以测试DUSP6对NTM的去磷酸化是否会导致泛素化降低。纯化NTM，然后与DUSP6孵育进行去磷酸化。然后将所得的NTM用作体外泛素化试验的样本。结果显示，NTM与DUSP6孵育后检测到总磷酪氨酸减少，同时，去磷酸化NTM上的泛素化量减少了约38%（图2f）。表明，DUSP6对NTM的去磷酸化可以降低NTM的泛素化。第四步，DUSP6抑制NTM泛素化以增强其稳定性接下来，探索DUSP6引发的NTM泛素化降低是否会导致蛋白酶体介导的降解变化。敲减DUSP6并使用MG132（一种有效的蛋白酶体抑制剂）处理细胞，检测NTM的水平。发现DUSP6敲减，NTM显著降低；MG132处理后，NTM水平增加（图2g）。此外，Co-IP实验分析显示DUSP6与NTM泛素化水平负相关，与NTM水平正相关（图2h）。表明DUSP6抑制NTM泛素化以增强其稳定性。
图2 DUSP6抑制泛素介导的NICD蛋白酶体降解（Ref. Fig 5/S7）
（3）DUSP6对Notch1的phospho-Y2116的去磷酸化是其调控CRC细胞增殖的关键
功能回复实验显示，DUSP6通过Notch1调控结直肠癌细胞增殖（图3a-b）。随后IP-MS筛选NTM上可能被DUSP6靶向的磷酸化位点。NTM中共检测到17个磷酸丝氨酸、3个磷酸苏氨酸和2个磷酸酪氨酸，其中只有phospho-Y2116（p-Y2116）是DUSP6过表达时失去磷酸化的酪氨酸残基。此外，两个丝氨酸残基S1951和S2205在DUSP6 过表达中也失去了磷酸化。
为了确定p-Y2116、p-S1951和p-S2205在Notch1信号传递中的重要性，构建Notch1失活突变体Y2116A、S1951A和S2205A，通过CSL（CBF1/RBP-Jκ）报告基因和Notch1通路报告基因检测。发现DUSP6过表达导致Notch1介导的转录活性增加，NICD Y2116A的细胞中转录活性增加（图3c）。表明在这三种突变中，只有Y2116A突变使NTM具有逃避泛素化和随后的蛋白酶体降解的能力。随后的功能实验也显示NTM WT和NTM Y2116A均能挽救DUSP6 KO细胞增殖减少的情况（图3d）。表明Y2116是DUSP6控制Notch1活性的磷酸化位点。
图3 DUSP6对Notch1的phospho-Y2116的去磷酸化是其调控CRC细胞增殖的关键（Ref. Fig 6）
结论：研究人员发现DUSP6可以作为Notch1的磷酸酶，从而调节NTM的稳定性和转录活性，从而影响结直肠癌（CRC）的发展。肿瘤中DUSP6高表达与较差的CRC患者总生存率相关，DUSP6表达升高与NTM水平升高相关。DUSP6过表达导致CRC细胞体外和体内增殖增强，DUSP6缺乏导致结直肠癌发展减少。在机制上，DUSP6使Notch1 phospho-Y2116去磷酸化，从而降低NTM泛素化，从而提高NTM的稳定性和转录活性。为靶向Notch1信号开发人类疾病治疗提供了新的途径。
2024年11月，新加坡国立大学团队在Nat Commun.（IF=14.7）上发表了题为“DUSP6 regulates Notch1 signalling in colorectal cancer”的研究成果。发现DUSP6是一种Notch1磷酸酶，揭示了Notch1在癌症中的调控和功能，并为靶向Notch1信号开发人类疾病治疗提供了新的途径。
Highlights如下：
1）肿瘤中DUSP6高表达与较差的CRC患者总生存率相关；
2）DUSP6促进细胞生长和迁移；
3）小鼠中DUSP6的缺失导致结肠肿瘤发展减少；
4）机制上，DUSP6使Notch1 phospho-Y2116去磷酸化，从而降低NTM泛素化，从而提高NTM的稳定性和转录活性，促进肿瘤细胞生长。
备注：Notch1在癌症中的激活是通过Notch1细胞内结构域的磷酸化来调节的。Notch1的激活是通过结合其配体，δ样蛋白1和3，或Jagged 1和2来启动的。随后经蛋白水解裂解，释放Notch细胞内结构域（NICD）， NICD易位到细胞核中转录增殖相关基因，如c-Myc。NICD的磷酸化调控其稳定性，是决定其生物活性的关键过程。虽然已知裂解的NICD通过相应的激酶磷酸化可以调节生物活性，但磷酸酶的调节仍未被探索。NTM：Notch1跨膜/细胞内区。
临床相关性：肿瘤中DUSP6高表达与与高NICD水平和较差的CRC患者总生存率相关。
功能研究：DUSP6表达升高导致CRC细胞体外和体内增殖增强，小鼠中DUSP6的缺失导致结肠肿瘤发展减少。
机制研究：（1）DUSP6抑制MAPKs的激活，增加Notch1 NTM的水平
第一步，DUSP6抑制MAPKs的激活
DUSP6已被证明主要靶向ERK1/2。WB检测显示，过表达DUSP6导致ERK1/2、p38和JNK的激活降低，敲除DUSP6则增加其激活（图1a）。另外，过表达DUSP6增加了增殖相关基因COX2和c-MYC的表达，DUSP6的缺失则相反（图1a-1b）。
第二步，DUSP6增加Notch1 NTM的水平
据报道Notch1与CRC患者预后较差相关。Notch1作为一种跨膜受体蛋白，其激活需要γ-分泌酶对其进行蛋白水解裂解，释放被裂解的Notch1细胞内区域，用于靶标增殖相关基因的转录激活或与其他细胞因子的合作。Notch1切割量的变化会对细胞增殖产生积极影响。DUSP6的过表达导致NTM（Notch1一个短的细胞外近膜肽和一个分子量为120 kDa的跨膜序列）水平升高，而敲除DUSP6导致NTM水平降低（图1c）。表明DUSP6的表达与NTM水平呈正相关。
图1 DUSP6抑制MAPKs的激活，增加Notch1 NTM的水平（Ref. Fig 2/S4）
（2）DUSP6抑制泛素介导的NICD蛋白酶体降解
被切割的Notch1细胞内区域作为转录激活因子，激活参与肿瘤发育的各种基因。切割的Notch1细胞内区域活性可以通过磷酸化来调节，以标记泛素介导的蛋白酶体降解。然而，没有报道任何负调节因子可以使Notch1细胞内区域去磷酸化，从而保持其细胞活性/丰度。DUSP6与NTM水平的相关性提示DUSP6可能调控NTM。
第一步，DUSP6与NTM结合Co-IP实验显示内源性NTM可与细胞中flag-DUSP6结合；同时，内源性DUSP6可与HA-NTM结合（图2a-b）。表明DUSP6与NTM结合。
第二步，DUSP6能够直接使NTM去磷酸化体外去磷酸化实验发现，与DUSP6孵育后，NTM上总磷酪氨酸的数量减少了约55%（图2c）。同样，DUSP6能够使内源性NTM去磷酸化（图2d-e）。表明DUSP6能够直接使NTM去磷酸化。
第三步，DUSP6对NTM的去磷酸化可以降低NTM的泛素化
接下来，进行连续的去磷酸化和泛素化实验，以测试DUSP6对NTM的去磷酸化是否会导致泛素化降低。纯化NTM，然后与DUSP6孵育进行去磷酸化。然后将所得的NTM用作体外泛素化试验的样本。结果显示，NTM与DUSP6孵育后检测到总磷酪氨酸减少，同时，去磷酸化NTM上的泛素化量减少了约38%（图2f）。表明，DUSP6对NTM的去磷酸化可以降低NTM的泛素化。第四步，DUSP6抑制NTM泛素化以增强其稳定性接下来，探索DUSP6引发的NTM泛素化降低是否会导致蛋白酶体介导的降解变化。敲减DUSP6并使用MG132（一种有效的蛋白酶体抑制剂）处理细胞，检测NTM的水平。发现DUSP6敲减，NTM显著降低；MG132处理后，NTM水平增加（图2g）。此外，Co-IP实验分析显示DUSP6与NTM泛素化水平负相关，与NTM水平正相关（图2h）。表明DUSP6抑制NTM泛素化以增强其稳定性。
图2 DUSP6抑制泛素介导的NICD蛋白酶体降解（Ref. Fig 5/S7）
（3）DUSP6对Notch1的phospho-Y2116的去磷酸化是其调控CRC细胞增殖的关键
功能回复实验显示，DUSP6通过Notch1调控结直肠癌细胞增殖（图3a-b）。随后IP-MS筛选NTM上可能被DUSP6靶向的磷酸化位点。NTM中共检测到17个磷酸丝氨酸、3个磷酸苏氨酸和2个磷酸酪氨酸，其中只有phospho-Y2116（p-Y2116）是DUSP6过表达时失去磷酸化的酪氨酸残基。此外，两个丝氨酸残基S1951和S2205在DUSP6 过表达中也失去了磷酸化。
为了确定p-Y2116、p-S1951和p-S2205在Notch1信号传递中的重要性，构建Notch1失活突变体Y2116A、S1951A和S2205A，通过CSL（CBF1/RBP-Jκ）报告基因和Notch1通路报告基因检测。发现DUSP6过表达导致Notch1介导的转录活性增加，NICD Y2116A的细胞中转录活性增加（图3c）。表明在这三种突变中，只有Y2116A突变使NTM具有逃避泛素化和随后的蛋白酶体降解的能力。随后的功能实验也显示NTM WT和NTM Y2116A均能挽救DUSP6 KO细胞增殖减少的情况（图3d）。表明Y2116是DUSP6控制Notch1活性的磷酸化位点。
图3 DUSP6对Notch1的phospho-Y2116的去磷酸化是其调控CRC细胞增殖的关键（Ref. Fig 6）
结论：研究人员发现DUSP6可以作为Notch1的磷酸酶，从而调节NTM的稳定性和转录活性，从而影响结直肠癌（CRC）的发展。肿瘤中DUSP6高表达与较差的CRC患者总生存率相关，DUSP6表达升高与NTM水平升高相关。DUSP6过表达导致CRC细胞体外和体内增殖增强，DUSP6缺乏导致结直肠癌发展减少。在机制上，DUSP6使Notch1 phospho-Y2116去磷酸化，从而降低NTM泛素化，从而提高NTM的稳定性和转录活性。为靶向Notch1信号开发人类疾病治疗提供了新的途径。
