PHLDA2与ALOX12相互作用
一、确定ROS铁死亡系统的相互作用分子
通过SFB标签抗体，进行IP-MS和IP-WB发现PHLDA2与ALOX12互作（图1a、b）。进一步通过内源抗体Co-IP双向验证PHLDA2与ALOX12存在相互作用（图1c-d）。而免疫荧光共定位实验发现PHLDA2和ALOX12能够同时共定位于细胞质（图1e），进一步佐证了PHLDA2-ALOX12复合体的存在。
二、确定PHLDA2和ALOX12互作特异性
PHLDA2属于PH样结构域家族A，包括PHLDA1、PHLDA2和PHLDA3（图1f）。Co-IP实验分析发现，PHLDA1、PHLDA2和PHLDA3中，只有PHLDA2与ALOX12相互作用（图1h-i）。
图1
三、确定互作的结构域（严谨）
为了确定PHLDA2与ALOX12互作的结构域，对PHLDA2分别构建PHLDA2全长、PHLDA2-PH、PHLDA2-ΔPH进行GST pulldown和Co-IP实验，发现ALOX12结合含有N端PH结构域(aa7-101)，但不结合含有C端结构域(ΔPH，aa102-152)（图2a-c）。另外，对PHLDA2分别构建PHLDA2全长、PHLDA2-BS、PHLDA2-ΔBS进行Co-IP实验分析，发现PHLDA2的高度保守的磷脂结合序列(BS，aa7-31)不是与ALOX12相互作用所必需的，但其旁边的一个小区域(ΔBS，aa32-101)是ALOX12的主要对接位点（图2a和2d）。
以上结果证实：PHLDA2与ALOX12直接相互作用。ALOX12是ROS铁死亡的催化酶，这种互作是调控铁死亡必须的吗？需要进一步探究！
图2
如有相关科研问题，欢迎随时留言探讨。
一、确定ROS铁死亡系统的相互作用分子
通过SFB标签抗体，进行IP-MS和IP-WB发现PHLDA2与ALOX12互作（图1a、b）。进一步通过内源抗体Co-IP双向验证PHLDA2与ALOX12存在相互作用（图1c-d）。而免疫荧光共定位实验发现PHLDA2和ALOX12能够同时共定位于细胞质（图1e），进一步佐证了PHLDA2-ALOX12复合体的存在。
二、确定PHLDA2和ALOX12互作特异性
PHLDA2属于PH样结构域家族A，包括PHLDA1、PHLDA2和PHLDA3（图1f）。Co-IP实验分析发现，PHLDA1、PHLDA2和PHLDA3中，只有PHLDA2与ALOX12相互作用（图1h-i）。
图1
三、确定互作的结构域（严谨）
为了确定PHLDA2与ALOX12互作的结构域，对PHLDA2分别构建PHLDA2全长、PHLDA2-PH、PHLDA2-ΔPH进行GST pulldown和Co-IP实验，发现ALOX12结合含有N端PH结构域(aa7-101)，但不结合含有C端结构域(ΔPH，aa102-152)（图2a-c）。另外，对PHLDA2分别构建PHLDA2全长、PHLDA2-BS、PHLDA2-ΔBS进行Co-IP实验分析，发现PHLDA2的高度保守的磷脂结合序列(BS，aa7-31)不是与ALOX12相互作用所必需的，但其旁边的一个小区域(ΔBS，aa32-101)是ALOX12的主要对接位点（图2a和2d）。
以上结果证实：PHLDA2与ALOX12直接相互作用。ALOX12是ROS铁死亡的催化酶，这种互作是调控铁死亡必须的吗？需要进一步探究！
图2
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