一、外泌体RNA提取重要性 外泌体是直径30-150 nm的细胞外囊泡，携带母细胞的蛋白质、脂质和核酸信息。其中，外泌体RNA因其稳定性高、功能多样，成为研究细胞间调控机制的关键分子。例如： •肿瘤标志物：血液外泌体中的miRNA可反映肿瘤进展。 •疾病治疗：外泌体RNA参与免疫调节和信号通路调控。 •无创诊断：相比组织活检，体液（如血液、尿液）中的外泌体RNA更易获取。 但外泌体RNA含量极低（仅占外泌体总成分的约1%），且易被降解，如何高效、高质量提取成为实验成败的核心。 二、外泌体RNA提取的四大方法 1. 超速离心法 原理：通过梯度离心逐步去除杂质，最终获得高纯度外泌体。 •优点：金标准，适用于多种样本（如血清、细胞上清）。 •缺点：耗时长（约6-8小时），设备要求高，可能损伤外泌体膜结构。 关键步骤： 1.样本预处理：低速离心（2000×g，30分钟）去除细胞碎片。 2.超速离心：10万×g，70分钟，重复2次。
2. 试剂盒法（如ExoQuick、Qiagen） 原理：利用聚合物沉淀外泌体，再通过裂解液释放RNA。 •优点：操作简单，耗时短（约1-2小时），适合小样本量。 •缺点：可能引入蛋白或多糖污染，影响下游测序。 关键试剂：PEG（聚乙二醇）是沉淀核心成分。 3. 超滤法 原理：利用不同孔径滤膜截留外泌体。 •优点：保留外泌体完整性，适合功能研究。 •缺点：滤膜易堵塞，回收率低。 4. 免疫磁珠法 原理：通过抗体（如CD63、CD9）特异性捕获外泌体。 •优点：特异性高，适用于特定亚群外泌体研究。 •缺点：成本高，抗体可能影响RNA释放
选择建议： •优先考虑样本类型：血清/血浆推荐超速离心法；细胞上清可用试剂盒法。 •结合下游实验：若需RNA测序，优先保证纯度；若研究外泌体功能，需保持结构完整。 三、外泌体RNA提取详细流程（以超速离心+试剂盒法为例） 前期准备 •样本处理： •血液样本：采集后30分钟内离心（2000×g，30分钟）分离血浆，-80℃保存。 •细胞上清：去除死细胞后，4℃保存不超过72小时。 •试剂与耗材：RNase-free离心管、TRIzol LS、氯仿、异丙醇等。
实验步骤 1.外泌体分离 •超速离心法：按上述步骤获得外泌体沉淀。 •试剂盒法：按说明书比例加入ExoQuick溶液，4℃过夜沉淀。 2.外泌体裂解 •加入TRIzol LS（含强变性剂），剧烈涡旋10分钟，充分裂解膜结构。 注意：裂解不彻底会导致RNA得率降低！ 3.RNA提取 •加入氯仿分层，离心后取上层水相。 •加入异丙醇沉淀RNA，75%乙醇洗涤。 •RNase-free水溶解沉淀。 4.质量检测 •浓度与纯度：Nanodrop检测A260/A280（理想值1.8-2.1）。 •完整性：Agilent 2100分析RIN值（外泌体RNA片段小，RIN值可能偏低）。 •特异性：qPCR检测外泌体标志基因（如TSG101、CD63）。
四、如何提高外泌体RNA的得率？ 1.样本富集：对于低浓度样本（如尿液），可先通过超滤浓缩。 2.联合使用蛋白酶K：消化外泌体表面蛋白，促进RNA释放。 3.避免反复冻融：解冻后立即提取，分装保存。