一、实验原理
通过将待研究启动子序列或miRNA结合位点克隆至荧光素酶报告载体，利用萤火虫荧光素酶（Firefly）作为主报告基因，海肾荧光素酶（Renilla）作为内参基因，检测基因调控元件的转录变化活性。
二、实验准备
1. 主要试剂与仪器
- 双荧光素酶检测试剂盒（含裂解液/底物）
- 报告质粒（含待测序列的pGL3载体）
- 内参质粒（pRL-TK/Renilla）
- 转染试剂
2. 质粒准备
- 将目的DNA片段克隆至pGL3-Basic载体
- 内参质粒使用pRL-TK
- 质粒浓度建议：1μg/μL
三、实验步骤
1. 细胞铺板（Day 1）
1. 取对数生长期细胞
2. 胰酶消化后计数，按2×10⁴ cells/孔接种于24孔板
3. 37℃、5% CO₂培养箱中培养过夜
2. 质粒转染（Day 2）
1. 质粒配制（每孔）：
- 实验组：0.8μg报告质粒 + 0.08μg内参质粒
- 对照组：空载体替换报告粒质
2. 转染复合物制备：
- 将质粒混合液与转染试剂按说明书比例混合
-室温静置15min形成复合物
3. 移除旧培养基，加入500μL新鲜培养基
4. 将转染复合物逐滴加入孔中，轻柔摇匀
5. 继续培养24-48小时
3. 细胞裂解
1. 取出培养板置于冰上预冷5min
2. 弃去培养基，用预冷PBS轻柔洗涤2次
3. 每孔加入100μL 1×被动裂解缓冲液
4. 水平摇床室温裂解15min（避光）
4. 荧光检测（关键步骤）
1. 将裂解液转移至1.5mL离心管
2. 12,000rpm离心5min（4℃），取上清
3. 检测顺序：
Step1 萤火虫荧光检测
取20μL上清+100μL LARⅡ底物
立即测定荧光值（延迟2s，积分10s）
Step2 海肾荧光检测
向同一反应管中加入100μL Stop&Glo®试剂
立即测定荧光值
5. 数据处理
1. 计算相对荧光素酶活性：
相对活性 = (Firefly荧光值) / (Renilla荧光值)
2. 实验组数据需与对照组进行标准化比较
3. 进行t检验统计分析
四、注意事项
1. 质粒质量要求：
- OD260/280=1.8-2.0
- 内毒素浓度<0.1EU/μg
2. 转染优化建议：
- 初次实验需设置梯度浓度（0.5-2μg）测试转染效率
- 建议设置3复孔/组
3. 检测关键点：
- 裂解后样品需在1h内完成检测
- 不同型号仪器需预先进行基线校准
- 避免反复冻融裂解液
4. 特殊处理：
- 若研究miRNA调控，需共转染miRNA mimics/inhibitor
- 药物处理应在转染后6h进行
五、结果解读
- 正常TK启动子的Renilla活性波动应<15%
- 有效数据需满足：Firefly活性值>背景值50倍
- 典型阳性对照（如pGL3-Control）活性应达到10⁶ RLU
通过将待研究启动子序列或miRNA结合位点克隆至荧光素酶报告载体，利用萤火虫荧光素酶（Firefly）作为主报告基因，海肾荧光素酶（Renilla）作为内参基因，检测基因调控元件的转录变化活性。
二、实验准备
1. 主要试剂与仪器
- 双荧光素酶检测试剂盒（含裂解液/底物）
- 报告质粒（含待测序列的pGL3载体）
- 内参质粒（pRL-TK/Renilla）
- 转染试剂
2. 质粒准备
- 将目的DNA片段克隆至pGL3-Basic载体
- 内参质粒使用pRL-TK
- 质粒浓度建议：1μg/μL
三、实验步骤
1. 细胞铺板（Day 1）
1. 取对数生长期细胞
2. 胰酶消化后计数，按2×10⁴ cells/孔接种于24孔板
3. 37℃、5% CO₂培养箱中培养过夜
2. 质粒转染（Day 2）
1. 质粒配制（每孔）：
- 实验组：0.8μg报告质粒 + 0.08μg内参质粒
- 对照组：空载体替换报告粒质
2. 转染复合物制备：
- 将质粒混合液与转染试剂按说明书比例混合
-室温静置15min形成复合物
3. 移除旧培养基，加入500μL新鲜培养基
4. 将转染复合物逐滴加入孔中，轻柔摇匀
5. 继续培养24-48小时
3. 细胞裂解
1. 取出培养板置于冰上预冷5min
2. 弃去培养基，用预冷PBS轻柔洗涤2次
3. 每孔加入100μL 1×被动裂解缓冲液
4. 水平摇床室温裂解15min（避光）
4. 荧光检测（关键步骤）
1. 将裂解液转移至1.5mL离心管
2. 12,000rpm离心5min（4℃），取上清
3. 检测顺序：
Step1 萤火虫荧光检测
取20μL上清+100μL LARⅡ底物
立即测定荧光值（延迟2s，积分10s）
Step2 海肾荧光检测
向同一反应管中加入100μL Stop&Glo®试剂
立即测定荧光值
5. 数据处理
1. 计算相对荧光素酶活性：
相对活性 = (Firefly荧光值) / (Renilla荧光值)
2. 实验组数据需与对照组进行标准化比较
3. 进行t检验统计分析
四、注意事项
1. 质粒质量要求：
- OD260/280=1.8-2.0
- 内毒素浓度<0.1EU/μg
2. 转染优化建议：
- 初次实验需设置梯度浓度（0.5-2μg）测试转染效率
- 建议设置3复孔/组
3. 检测关键点：
- 裂解后样品需在1h内完成检测
- 不同型号仪器需预先进行基线校准
- 避免反复冻融裂解液
4. 特殊处理：
- 若研究miRNA调控，需共转染miRNA mimics/inhibitor
- 药物处理应在转染后6h进行
五、结果解读
- 正常TK启动子的Renilla活性波动应<15%
- 有效数据需满足：Firefly活性值>背景值50倍
- 典型阳性对照（如pGL3-Control）活性应达到10⁶ RLU
