在科学研究中，定量PCR（qPCR）和Western Blotting（WB）是两种常用的实验技术，用于检测和分析基因表达和蛋白质水平。然而，令人困惑的是，有时相同样本在qPCR和WB实验中的结果可能会出现不一致现象。为什么会出现这种差异？
下面我们从实验技术、生物学及数据处理与分析三个方面来进行分析。
01实验技术层面
样本处理和准备的差异：qPCR实验需要从样本中提取RNA，而WB实验则需要提取蛋白质。样本处理的差异可能导致样本中RNA或蛋白质的质量和纯度不同，影响到最终的实验结果。
实验设计的差异：引物设计和抗体选择是qPCR和WB实验的关键步骤。不同的引物或抗体可能对基因或蛋白的检测敏感性产生影响，导致结果差异。
实验条件和操作的差异：qPCR和WB实验在条件和操作上存在不同。例如，PCR循环条件、抗体结合条件和膜的截留条件等方面的差异可能造成结果不一致。
技术的特异性和灵敏度qPCR和WB技术对基因和蛋白质的检测特异性和灵敏度不同，可能导致在不同实验条件下的不一致结果，尤其是对低表达基因或蛋白质的检测可能存在一定的误差。因此，实验条件的严格控制和结果的准确解读对于减少这种不一致性至关重要。
02生物学层面的原因
首先，转录后调控的差异是导致qPCR和WB结果不一致的一个重要因素。qPCR测量的是基因的转录水平，而WB测量的是蛋白质的表达水平。在细胞中，基因的表达受到转录后调控的影响，包括转录后修饰以及蛋白质的合成和降解等过程。因此，基因的转录水平和蛋白质的表达水平之间可能存在不一致。例如，mRNA的稳定性、可变剪接、miRNA的抑制作用等都可能影响最终蛋白质的表达。
其次，后转录修饰的影响也不容忽视。蛋白质的功能通常受到后转录修饰的调控，例如磷酸化、甲基化等修饰可以改变蛋白质的活性和稳定性。这种后转录修饰在WB实验中可以被检测到，而在qPCR中则无法直接测量，导致结果不一致。这些修饰可能影响蛋白质的稳定性和功能，从而影响其在细胞中的积累和活性。
再者，蛋白质的稳定性和降解也是影响qPCR和WB结果一致性的关键因素。蛋白质的稳定性和降解速率也会影响其在细胞中的表达水平。如果蛋白质的降解速率高于其合成速率，WB测量的蛋白质表达水平可能偏低，与qPCR结果不一致。例如，某些蛋白质可能非常稳定，即使mRNA水平下降，蛋白质水平也可能暂时保持不变或缓慢下降。
此外，细胞生理状态的影响也不容忽视。细胞的生理状态和环境变化也会影响基因表达和蛋白质表达水平。例如，细胞的应激、外界刺激、细胞周期等因素可能导致在qPCR和WB实验中观察到不一致的结果。这些因素可能通过影响转录因子的活性、信号传导途径的激活等方式，间接影响基因和蛋白质的表达。
翻译后调控和修饰影响也是导致qPCR和WB结果不一致的一个重要因素。蛋白翻译后的调控和修饰过程可能导致蛋白质的产量明显增加，即使mRNA水平没有显著变化。磷酸化、糖基化和其他修饰过程可能影响蛋白质的结构、功能和稳定性，导致WB结果与qPCR结果不一致。
延迟效应也是一个需要考虑的因素。蛋白合成需要时间，而mRNA的表达可以迅速响应外界刺激。因此，在某些情况下，mRNA的变化可能在蛋白水平变化之前或之后发生，导致两者之间结果不一致。这种时间差可能导致实验结果的不一致性，尤其是在动态变化的生物学过程中。
mRNA剪接的多变性也是一个不容忽视的因素。不同剪接体的转录后mRNA对蛋白质表达产生影响。qPCR通常只扩增和检测其中一种剪接体，因此即使某一剪接体下降，其他剪接体的增加可能导致蛋白水平的提高，这种情况需要特别注意。最后，蛋白翻译后的稳定性也是一个重要的考虑因素。蛋白质在翻译后各种修饰可能影响其稳定性。例如，增加泛素化修饰可能促进蛋白通过蛋白酶体途径进行降解，导致蛋白水平下降。
此外，负反馈机制调节也可能导致mRNA和蛋白质水平的不一致。细胞内存在负反馈机制调节mRNA和蛋白质水平。某些情况下，即使mRNA水平未变化，蛋白水平也可能显著增加，这可能是由于翻译后调节的影响。
03数据处理与分析层面
定量方法的差异qPCR和WB采用的定量方法不同，这可能是导致结果不一致的一个原因。qPCR通过检测荧光信号的变化来实时定量PCR扩增产物量的变化，这种方法的灵敏度和定量范围相对较宽。而WB则通过抗体与蛋白质的结合来检测蛋白质的表达水平，这种方法的定量范围和灵敏度可能与qPCR存在差异，导致结果不一致。
结果解读的主观性WB结果的分析往往需要根据蛋白质条带的颜色和深浅来判断蛋白质的表达水平，这种判断过程存在一定的主观性。不同研究者对同一结果可能产生不同的解读，这可能导致结果的不一致。
下面我们从实验技术、生物学及数据处理与分析三个方面来进行分析。
01实验技术层面
样本处理和准备的差异：qPCR实验需要从样本中提取RNA，而WB实验则需要提取蛋白质。样本处理的差异可能导致样本中RNA或蛋白质的质量和纯度不同，影响到最终的实验结果。
实验设计的差异：引物设计和抗体选择是qPCR和WB实验的关键步骤。不同的引物或抗体可能对基因或蛋白的检测敏感性产生影响，导致结果差异。
实验条件和操作的差异：qPCR和WB实验在条件和操作上存在不同。例如，PCR循环条件、抗体结合条件和膜的截留条件等方面的差异可能造成结果不一致。
技术的特异性和灵敏度qPCR和WB技术对基因和蛋白质的检测特异性和灵敏度不同，可能导致在不同实验条件下的不一致结果，尤其是对低表达基因或蛋白质的检测可能存在一定的误差。因此，实验条件的严格控制和结果的准确解读对于减少这种不一致性至关重要。
02生物学层面的原因
首先，转录后调控的差异是导致qPCR和WB结果不一致的一个重要因素。qPCR测量的是基因的转录水平，而WB测量的是蛋白质的表达水平。在细胞中，基因的表达受到转录后调控的影响，包括转录后修饰以及蛋白质的合成和降解等过程。因此，基因的转录水平和蛋白质的表达水平之间可能存在不一致。例如，mRNA的稳定性、可变剪接、miRNA的抑制作用等都可能影响最终蛋白质的表达。
其次，后转录修饰的影响也不容忽视。蛋白质的功能通常受到后转录修饰的调控，例如磷酸化、甲基化等修饰可以改变蛋白质的活性和稳定性。这种后转录修饰在WB实验中可以被检测到，而在qPCR中则无法直接测量，导致结果不一致。这些修饰可能影响蛋白质的稳定性和功能，从而影响其在细胞中的积累和活性。
再者，蛋白质的稳定性和降解也是影响qPCR和WB结果一致性的关键因素。蛋白质的稳定性和降解速率也会影响其在细胞中的表达水平。如果蛋白质的降解速率高于其合成速率，WB测量的蛋白质表达水平可能偏低，与qPCR结果不一致。例如，某些蛋白质可能非常稳定，即使mRNA水平下降，蛋白质水平也可能暂时保持不变或缓慢下降。
此外，细胞生理状态的影响也不容忽视。细胞的生理状态和环境变化也会影响基因表达和蛋白质表达水平。例如，细胞的应激、外界刺激、细胞周期等因素可能导致在qPCR和WB实验中观察到不一致的结果。这些因素可能通过影响转录因子的活性、信号传导途径的激活等方式，间接影响基因和蛋白质的表达。
翻译后调控和修饰影响也是导致qPCR和WB结果不一致的一个重要因素。蛋白翻译后的调控和修饰过程可能导致蛋白质的产量明显增加，即使mRNA水平没有显著变化。磷酸化、糖基化和其他修饰过程可能影响蛋白质的结构、功能和稳定性，导致WB结果与qPCR结果不一致。
延迟效应也是一个需要考虑的因素。蛋白合成需要时间，而mRNA的表达可以迅速响应外界刺激。因此，在某些情况下，mRNA的变化可能在蛋白水平变化之前或之后发生，导致两者之间结果不一致。这种时间差可能导致实验结果的不一致性，尤其是在动态变化的生物学过程中。
mRNA剪接的多变性也是一个不容忽视的因素。不同剪接体的转录后mRNA对蛋白质表达产生影响。qPCR通常只扩增和检测其中一种剪接体，因此即使某一剪接体下降，其他剪接体的增加可能导致蛋白水平的提高，这种情况需要特别注意。最后，蛋白翻译后的稳定性也是一个重要的考虑因素。蛋白质在翻译后各种修饰可能影响其稳定性。例如，增加泛素化修饰可能促进蛋白通过蛋白酶体途径进行降解，导致蛋白水平下降。
此外，负反馈机制调节也可能导致mRNA和蛋白质水平的不一致。细胞内存在负反馈机制调节mRNA和蛋白质水平。某些情况下，即使mRNA水平未变化，蛋白水平也可能显著增加，这可能是由于翻译后调节的影响。
03数据处理与分析层面
定量方法的差异qPCR和WB采用的定量方法不同，这可能是导致结果不一致的一个原因。qPCR通过检测荧光信号的变化来实时定量PCR扩增产物量的变化，这种方法的灵敏度和定量范围相对较宽。而WB则通过抗体与蛋白质的结合来检测蛋白质的表达水平，这种方法的定量范围和灵敏度可能与qPCR存在差异，导致结果不一致。
结果解读的主观性WB结果的分析往往需要根据蛋白质条带的颜色和深浅来判断蛋白质的表达水平，这种判断过程存在一定的主观性。不同研究者对同一结果可能产生不同的解读，这可能导致结果的不一致。
