8月下旬，大流士在巴比伦举行盛大阅兵式，然后大军启程。来自中亚草原的数万骑兵因为路途遥远，没有按时赶到，错过了伊苏斯战役(这些部队两年后参加了高加米拉战役)。波斯大军整整花了五天才渡过幼发拉底河，向叙利亚进发。古典史家对波斯大军的数量众说纷纭，阿里安记载伊苏斯参战的波斯军队有60万人，罗马史学家科丘斯(Quintus Curtius Rufus)认为有25万人，现代史学家大多估计大流士的作战部队不超过10万人。大流士在索克依安营扎寨，等待了一个多月，依然不见亚力山大的踪影。大流士并不知道亚力山大此时身患重病卧床不起，他只能通过零零碎碎的情报揣测亚力山大的意图和动向。这就是军事史学家所谓的“战争迷雾”(The Fog of War)，在古典时代的通讯条件下，双方统帅都缺乏可靠的情报，如同笼罩在迷雾当中，战争决策很多时候和赌博一般。大流士最终决定放弃索克依这个预设战场，率军进入西里西亚寻找亚力山大的主力。
古典史料记载，当大流士犹豫不决之时，希腊雇佣军将领们极力主张在索克依按兵不动，等亚力山大来攻。如果大流士一定要进军西里西亚，那他应该兵分两路，挑选最精锐的波斯军队随行，而将家属和后勤辎重部队留下，因为西里西亚狭窄的海岸地形并不利于大军团作战。波斯贵族则认为亚力山大一定被波斯大军的兵势所震慑，不敢前来迎战，此时正应该直捣黄龙。大概对卡里德姆的羞辱依然耿耿于怀，波斯将领强烈反对希腊将领的提议，指责他们别有用心，想削弱大流士的兵力，伺机叛乱将他至于死地。大流士并没有听信波斯贵族的谗言，而是诚恳地感谢希腊雇佣军将领的忠心耿耿，并耐心向他们解释了建议未被采纳的原因。
虽然古典史料并没有留下详细的记录，大流士的决策思路依然有迹可循。显然大流士对蒙农的战略构想依然满怀信心，对活跃在爱琴海的波斯舰队寄予厚望。他知道马其顿海军孱弱，而亚力山大过去的一年中用大部分时间攻占小亚细亚的港口，以对抗波斯海军的威胁。现在大流士最担心的就是亚力山大拒绝应战，而是派兵扼守阿曼山脉的各个山口，然后挥师南下去攻打波斯海军主力来源的腓尼基(Phoenicia，今天黎巴嫩境内)。不久帕米尼奥军团在叙利亚山口附近扎营，并派兵控制了山口，更加印证了大流士的判断。事实上亚力山大的战略思路的确如此，伊苏斯战役以后他并没有乘胜追击进入两河流域，而是继续沿着叙利亚海岸南下，进攻腓尼基和埃及。大流士此时就面临一个战略抉择，继续留在索克依等候，虽然可以保有战场优势，却丧失了主动权，给予亚力山大战略机动的空间，坐视海军基地的覆灭；如果要掌握主动权，就必须进入西里西亚保持同敌军的接触，这样就不得不接受海岸狭窄地形的限制。可见大流士最后的决定是经过缜密的考虑权衡才做出的。
大流士领军北上之前，派遣阿塔巴兹的儿子科封(Cophen)率领三万军队南下据守叙利亚的大马士革城。大马士革南去索克依300公里，远离战区，大流士派遣这支部队显得没有道理。古典史家通常认为科封军团的任务是护送2,600塔伦黄金到大马士革，这个解释相当勉强，因为用三万军队护送黄金太过兴师动众。如果我们注意到大马士革西南方向100公里的地方便是腓尼基首都推罗城(Tyre)，大流士此举的战略意图就很明显了 - 科封军团的任务并不是卫戍黄金，而是和推罗城互为犄角，准备拦截亚力山大的南犯，同大流士的主力部队形成一个南北夹击的有利局面。
接下来大流士走出一步绝妙好棋，将亚力山大逼入绝境。大流士并没有就近从叙利亚山口进入西里西亚，而是北上100公里借道阿曼山口。古典史家认为大流士绕道是因为叙利亚山口已经被马其顿军队控制，这显然又低估了大流士的谋略。虽然我们并不清楚大流士是否掌握了亚力山大的动向，但波斯大军在索克依驻扎将近两个月，大流士可以肯定亚力山大早已知道他的位置。即使亚力山大不愿前来迎战，他也应该率领大部队南下同帕马尼奥汇合，隔着叙利亚山口同波斯军队对峙。大流士挥师北上从阿曼山口进入西里西亚，战略意图非常明显，那就是迂回到亚力山大的背后断其退路。事实证明大流士的判断非常正确，波斯军队通过无人防守的阿曼山口，出现在伊苏斯河谷时，亚力山大刚刚南下同帕米尼奥汇合。波斯军队轻取伊苏斯的马其顿大营，掳获大批物资，俘虏数百伤兵。大流士下令将马其顿伤兵剁去双手，放他们去向亚力山大报信，期望这个噩耗摧毁马其顿军队的士气。此时的大流士一定志得意满，成竹在胸。

2. 名将本色
同古今所有的名将一样，亚力山大对自己的判断非常自信，敢于冒险孤注一掷。伊苏斯战役开局阶段，亚力山大非常罕见的连续犯了几次判断错误，结果使马其顿大军陷入绝境。首先亚力山大认为波斯军队不会轻易放弃索克依的地利条件，因此率领大军南下叙利亚山口；其次亚力山大似乎并不知道阿曼山口的存在，没有派一兵一卒扼守，也没有在伊苏斯大营留下卫戍部队。当马其顿伤兵带来伊苏斯大营失陷的消息，亚力山大最初的反应是难以置信，他派人乘坐快艇到伊苏斯附近侦查，结果确实了这个消息。
亚力山大面临一个极端凶险的局面。他的军队被抄了后路，后勤补给断绝，没有增援部队可以指望，他必须在粮草耗尽以前领军赶回伊苏斯，以疲惫之师迎战数倍于己的波斯大军。波斯军队断绝后路的消息很快传遍全军，马其顿将士的惊惧不安可想而知。任何将领面对这样的战役开局都会不免胆寒，但越是困难，亚力山大越是豪情万丈。他立刻召集将领讨论战局，充满信心地激励大家，认为这是同波斯王决战的天赐良机，而狭窄的海岸地形将使波斯军队的兵力优势无法发挥。历史证明，只要波斯军队接受决战，希腊军队总是能够取得胜利。亚力山大的热情和自信深深感染了每一个人，本来垂头丧气的马其顿将官顿时士气高涨，人人用短剑敲打着盾牌，渴望和波斯人决一死战。
与此同时，大流士率领波斯大军从伊苏斯南进20公里，在皮纳罗河畔安营扎寨，这里距离亚力山大的营地大约30公里。大流士离开地形相对开阔的伊苏斯，来到狭窄的皮纳罗河谷，让人难以理解。古典史料记载，波斯大军在皮纳罗河谷乱糟糟地宿营，部队纪律松懈，人马随意走动，根本不象是准备决战的架式。显然大流士也犯了一个判断错误，他依然没有摆脱传统的波斯思维，认为拥有绝对优势兵力的波斯大军断了马其顿军队的后路，这足以摧毁马其顿人的抵抗意志。大流士率军南进到皮纳罗河谷，目的并不是寻求决战，而是进一步向马其顿军队施加压力，瓦解他们士气，促使他们自动请降。大流士重复了一百多年前薛西斯在温泉关所犯的判断错误，但这一次大流士可没有他的祖先那么幸运了。
次日清晨，亚力山大率领马其顿大军以每小时五公里的速度向北进发。皮纳罗河以南约10公里有一处关口，称作“约拿之柱”(Pillars of Jonah)，这里阿曼山脉直逼海岸，最狭窄的地方仅能容四人并排通过。马其顿大军正午以前就到达约拿之柱，然后足足花了四个小时才全部通过。亚力山大命令马其顿密集阵先行，通过关口以后立刻展开，以防备波斯骑兵的袭击。约拿之柱以北地形逐渐开阔，到皮纳罗河畔达到三公里宽。马其顿军队的阵形随着地形不断展开，两翼始终保持同海岸和山脉的接触。
正午过后，当马其顿军队出现在约拿之柱关口时，波斯骑兵飞报大流士。古典史料记载，大流士得知这个消息相当沮丧，而散布在河谷各处的波斯军队乱成一团，有的连忙收拾细软躲到阵营后面，有的跑到山坡上看个究竟，这说明大流士和波斯军队并没有决战的心理准备。不过大流士很快打起精神，立刻开始调兵遣将。他先派一万骑兵和数千弓箭手到皮纳罗河南岸布阵，形成一道屏障。这样做显然是为了稳定军心，让他能够从容布阵(阿里安记载这些部队有三万骑兵和两万步兵，显然是过于夸张了)。
此时大流士仍然占据战略优势，可以选择决战或固守。面对亚力山大背水一战的姿态，其实最明智的选择应该是掘壕固守，消磨马其顿人的锐气。只要坚持一个星期，马其顿军队就会断粮，不战自溃。以大流士的老谋深算，这一点他不会没有想到。但可惜的是，大流士最终决定应战，白白放弃了他的战略优势。大流士如何做出这个致命的错误决定，我们已经无从知晓。也许他对自己的部队依然抱有幻想，毕竟波斯大军数倍于对手，而且有希腊雇佣军、波斯铁甲骑兵、和卡尔达克重装步兵这样强悍的部队。也许他希望光明正大地赢得战役的胜利，也赢得波斯贵族发自内心的拥戴。当代史学家施特劳斯(B. S. Strauss)和奥伯(J. Ober)的一段评论很说明问题：“大流士无法奢望他的权力基础固若金汤，如果他逃避决战，如果他显得过于依赖希腊顾问，如果他允许波斯帝国的领地成为焦土，那么他立刻就会被指控为胆怯和叛国。” 看来面对亚力山大的挑战，大流士纵有满腹谋略也是枉然，除了应战别无选择。

亚力山大看到马其顿的左翼远端过于薄弱，立刻将右翼的1,800特萨利重骑兵调到左翼。这里亚力山大展现了高超的指挥艺术，他命令特萨利骑兵悄无声息地贴着马其顿密集阵的后面向左移动，大流士的视线被竖立如林的马其顿长矛遮挡，对这个调动毫无察觉。亚力山大并没有把特萨利骑兵部署在马其顿密集阵的左侧，而是让他们藏在方阵后面作为一支奇兵，接受帕米尼奥的指挥。这支奇兵在战役当中起到了非常关键的作用。接下来亚力山大派出两个营的近卫骑兵600人，在2千游击步兵和1千标枪手的支持下向右侧山坡上的波斯步兵发起攻击，以消除他们对马其顿侧翼的威胁。经过短暂的战斗，波斯步兵被迫放弃缓坡上的阵地，远远退到山麓之上。亚力山大随后派遣300轻骑兵留在山坡上监视警戒，将其他部队撤回本阵。
当马其顿军队前进到波斯军队的弓箭射程之外时，亚力山大下令部队原地稍息。他照例策马驰过马其顿阵线检阅部队，慷慨激昂地发表演说鼓舞士气。与此同时，波斯军队的将领们也在阵前向他们各自的部队大声训话，进行战前动员，各种语言的呼喊声此起彼伏，在河谷中回荡。马其顿将士群情激昂，发出惊天动地的“战吼”(War Cry)，波斯阵营不甘示弱，也以海啸般的吼叫回应，而数千面波斯战鼓开始擂响，震耳欲聋。伊苏斯战役一触即发。
4. 决战
亚力山大率领马其顿大军继续稳步前进，不时停顿以保持阵线的完整紧凑。马其顿右翼的近卫骑兵率先进入波斯人的弓箭射程，正停下来等待左侧的近卫步兵方阵跟上来，河对岸的波斯弓箭手立刻万箭齐发。古典史料记载，波斯人发射的羽箭如此密集，以至于在空中相互碰撞，据此我们可以推测，这应该是来自波斯步兵阵营后面的弓箭手以45度高射角的齐射。虽然波斯箭雨未能对近卫骑兵造成足够威胁，但有数十匹战马受惊狂跳，亚力山大见此情况，不等步兵跟上来，率先冲向敌阵，他的近卫骑兵各个连队以楔形队形紧跟其后。马其顿骑兵冲进皮纳罗河时，又遭遇波斯马迪亚部队迎面而来密如飞蝗的弓箭直射。大概在波斯人三次齐射的功夫，亚力山大就率领近卫骑兵冲到近前。马迪亚弓箭手魂飞魄散，纷纷转身逃命，慌不择路，冲乱了后面的卡尔达克密集阵。接踵而至的马其顿重骑兵如摧枯拉朽一般突入波斯步兵阵线，而近卫步兵各个方阵也陆续过河接敌，将波斯防线的缺口越撕越大。
由于波斯步兵方阵异常厚实，马其顿重骑兵突进敌阵以后很快就陷入人海寸步难行。近卫骑兵习惯于高速冲击，并不擅长在狭小空间里同步兵肉搏，这时马其顿军队的步骑协同发挥了威力。跟进的近卫步兵投出手中的长矛以后，纷纷拔出短剑冲入敌阵格斗。罗马史学家科丘斯写道：“双方阵线犬牙交错，士兵挥舞着刀剑格挡劈砍，向对手暴露的面部猛刺。现在即使胆怯懦弱的人也无法逃避战斗，双方步兵逼近肉搏，只有对手倒下才能前进一步。虽然(马其顿步兵)撕杀得筋疲力尽，他们的对手依然前仆后继冲到面前，而伤者根本无法撤下战场，因为敌人不断涌来，而自己的战友拼命在身后向前推挤。” 在马其顿军队步骑协同的凌厉攻势之下，波斯左翼阵线不久便土崩瓦解。
几乎在亚力山大率领近卫骑兵发动进攻的同时，波斯右翼的铁甲骑兵也向马其顿左翼远端发起冲锋。由于这里的战场宽度不足500米，波斯骑兵不得不采取添油战术，逐次投入兵力。第一攻击波的数千铁甲骑兵组成密集队形冲过皮纳罗河，朝600希腊联盟骑兵猛扑过来，很快将他们击溃，然后整体左转，向马其顿左翼阵线的侧后迂回包抄，从两面攻击步兵密集阵左侧的2千弓箭手和标枪手。马其顿左翼阵线岌岌可危。在这关键时刻，亚力山大部署在密集阵后面的1,800特萨利重骑兵发动反击，猛攻波斯骑兵的右侧，一举冲散了敌军的队形，逼迫波斯骑兵后退重新集结。特萨利骑兵以连为单位组成菱形战术队形，可以轻易调整进攻方向，他们向忙于集结的波斯骑兵连续发动短促突击，最后将波斯人驱逐到河对岸。特萨利骑兵乘胜渡河追击，同波斯骑兵的主力部队发生激战，由于兵力悬殊，战况胶着起来。

据阿里安统计，伊苏斯战役马其顿军队阵亡骑兵150人，步兵300人，4,500人受伤。后世史学家认为马其顿方面5,000人的伤亡数字大致准确，但伤亡比例至少应该是4比1，这样估算阵亡将士有1,200人。阿里安记载的波斯军队阵亡6万人显然言过其实。根据古典史料关于希腊雇佣军8千人幸存的记录，可以估算希腊雇佣军伤亡12,000人，其中绝大部分战死；战役当中波斯骑兵并没有遭到沉重打击，最后全身而退；卡尔达克步兵元气大伤，自此以后从波斯军队的序列中消失，损失必定惨重。波斯军队溃退当中互相践踏死伤甚众，考虑到战败一方伤者的存活率极低，可以估算波斯方面阵亡将士至少在2万人以上。
5. 战役总结
总结伊苏斯战役，波斯王大流士的战役指挥几乎无可挑剔，战略布局和战术安排都可圈可点。和亚力山大一样，大流士将精英部队放在右路，期望波斯铁甲骑兵在这里突破，迂回到侧后攻击马其顿密集阵。如果不是亚力山大有针对性地部署反击力量，波斯铁骑将轻松完成战役目标。大流士在中路的战术意图非常清楚，就是诱使马其顿密集阵渡河进攻，利用地形的阻碍打乱马其顿方阵的队形，这样希腊雇佣军可以避开马其顿步兵密集的长矛，从敌军阵形出现的缺口乘虚而入，逼近格斗。这个战术安排已经奏效，当时马其顿密集阵被希腊雇佣军多处渗透，千疮百孔，危在旦夕，如果左翼波斯步兵坚持时间再长一些，马其顿密集阵就会崩溃。一百多年以后，罗马军团就是使用同样的战术两次击破了马其顿军队，建立了在地中海东部的霸权。波斯左翼阵线的任务非常单纯，就是尽可能迟滞马其顿近卫骑兵的进攻，为波斯军队在中路和右路击破敌军争取时间。
后人对大流士排兵布阵的诟病，主要集中在左翼阵线的安排。有人认为大流士应该在波斯左翼和中路前沿全都部署希腊雇佣军，这就忽视了他政治上的局限性。大流士将希腊雇佣军布置在中路要冲委以重任，想必已经承受了波斯贵族巨大的压力，如果不给波斯步兵部队参战的机会，他将肯定会失去波斯贵族的支持。伊苏斯战役失败以后，大流士在逃命途中仍然没有放弃对全局的掌控。古典史料记载，从伊苏斯战场撤退的部分波斯骑兵没有返回巴比伦，而是退往小亚细亚，在那里开展敌后游击战。我们几乎可以肯定，波斯骑兵的这个战略举措完全是大流士的授意。这些波斯骑兵给马其顿军队的后勤补给造成很大困难，坚持一年多后被驻守小亚细亚的马其顿将领安提贡(Antigonus)率部歼灭。
伊苏斯战役波斯军队的惨败，主要原因是部队的组织和素质同马其顿军队差距太大。卡尔达克步兵作为波斯帝国军事改革的主要成果，战斗效能仍然无法同马其顿步兵相提并论。波斯左翼阵线过早崩溃，使大流士的战役构想成为泡影。波斯铁甲骑兵的单兵作战能力并不亚于特萨利骑兵，唯一的差距在于组织纪律性。另外波斯军队缺乏步骑协同，骑兵打开局面以后得不到步兵的支持，无法巩固战果，也是失败的原因之一。可见武器装备的提升，并不能弥补战术思想的差距。至于大流士的临阵脱逃，在当时的情况下无可厚非。波斯左翼阵线崩溃以后败局已定，大流士遭到马其顿骑兵的围攻，继续留在战场上只怕凶多吉少。对大流士来说，波斯帝国的战争资源取之不尽、用之不竭，只要保住一条性命就有机会东山再起。事实上大流士回到巴比伦又重新组建一支更加庞大的军队，而两年以后双方重逢高加米拉，亚力山大面临的险境一点也不亚于伊苏斯战役。