摘要：
本文介绍了一种可同步检测饲料中黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和呕吐毒素含量的高效液相色谱分析方法。样品用乙腈-水（6+4，v/v）提取，经涡旋、高速离心，移取2 mL上清液与28 mL含1% Tween-20的磷酸缓冲盐溶液（PBS，pH 7.0）混匀，过三合一免疫亲和柱净化，用2 mL甲醇洗脱；洗脱液经50℃氮气吹干后用50%甲醇-水复溶，采用高效液相色谱仪串联光化学衍生器、荧光检测器和紫外检测器进行检测。结果表明：黄曲霉毒素B1在2.5~50.0 ng/mL、玉米赤霉烯酮在50~2 500 ng/mL、呕吐毒素在250~5 000 ng/mL浓度范围内线性关系良好，平均加标回收率在81.2%~92.3%之间，相对标准偏差为4.3%~9.5%，表明该方法准确度和精密度高，可用于饲料中黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮及呕吐毒素的准确定量分析。（饲料液相色谱仪生产商）
正文：
全球每年约有25%的谷物受到霉菌毒素污染，给畜牧业造成了巨大经济损失。目前已发现的霉菌毒素有200多种，其中黄曲霉毒素（Aflatoxins, AFs）、玉米赤霉烯酮（Zearalenone, ZEA）和呕吐毒素（Deoxynivalenol, DON）是饲料中最常见的3类霉菌毒素。黄曲霉毒素是一类主要由黄曲霉和寄生曲霉产生的次级代谢产物，常见有AFB1、AFB2、AFG1、AFG2，以AFB1毒性最强，具有致癌性；ZEA主要由镰刀菌产生，具有高毒性，广泛存在于玉米、小麦等饲料原料中，是一种雌激素类似物，可导致畜禽性激素机能紊乱，还具有一定程度的肝毒性、遗传毒性及免疫毒性；DON又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇，是由镰刀菌属产生的低分子量次级代谢产物，可导致畜禽胃肠功能紊乱，皮肤黏膜损伤以及免疫功能下降。（饲料液相色谱仪生产商，中仪盟一站式供应链平台）
我国饲料卫生标准（GB 13078-2017）中规定了各霉菌毒素的限量，如AFB1在玉米加工产品中的最高限量为50 μg/kg，在仔猪配合饲料中限量10 μg/kg；ZEA在玉米等饲料原料中限量0.5 mg/kg；DON在植物性饲料原料中限量5 mg/kg，在猪配合饲料中限量1 mg/kg。建立饲料中霉菌毒素的检测方法对于筛选合格饲料、保障畜禽机体健康及畜禽产品安全具有重要意义。目前，霉菌毒素的检测方法主要有薄层色谱法、免疫层析法、酶联免疫吸附法、高效液相色谱法以及液相色谱-串联质谱法，其中薄层色谱法、免疫层析法和酶联免疫吸附法主要用于霉菌毒素的快速筛检，而高效液相色谱法和液相色谱-串联质谱法则用于霉菌毒素的定量分析。高效液相色谱法对仪器设备要求低，但通常只能用于单种霉菌毒素的检测；液相色谱-串联质谱法可用于多种霉菌毒素的同步检测，但仪器设备昂贵且维护成本高，不适于基层实验室对霉菌毒素的定量分析。目前可同步检测多种霉菌毒素的液相色谱方法相关文献报道较少。本文介绍了一种AFB1、ZEA及DON同步检测的液相色谱方法，可为基层实验室开展饲料中霉菌毒素的准确定量检测提供技术参考。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
1.1.1 高效液相色谱仪：Agilent Technologies 1200系列，美国Agilent Technologies公司；1.1.2 超纯水仪：Millipore Milli-Q纯化系统，美国Merck Millipore公司；1.1.3 电子分析天平：BSA124S，德国赛多利斯科学仪器有限公司；1.1.4 旋涡混合器：HQ-60-Ⅱ，北京同方公司；1.1.5 高速冷冻离心机：3-30K型，德国Sigma公司；1.1.6 Clover光化学衍生器，IAC-SEP® ADZ免疫亲和柱：北京中检维康生物技术有限公司；1.1.7 SymmetryShield RP18色谱柱(4.6×150 mm，5 μm)：沃特世科技（上海）有限公司；1.1.8 HSC-24B水浴氮吹仪：天津恒奥科技发展有限公司；1.1.9 甲醇、乙腈：色谱纯，德国Merck公司；1.1.10 AFB1、ZEA、DON标准品：美国Sigma公司；1.1.11 Tween-20：分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；1.1.12 氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾：分析纯，北京化工厂有限责任公司；1.1.13 PBS缓冲液（pH7.0）：称取8.0 g氯化钠，1.44 g磷酸氢二钠，0.24 g磷酸二氢钾，0.2 g氯化钾，用990 mL纯水溶解，然后用浓盐酸调节pH值至7.0，最后用纯水稀释至1 000 mL。1.2 色谱条件色谱柱：SymmetryShield RP18色谱柱（4.6×150 mm，5 μm）。流动相组成为甲醇（有机相）和水（水相），荧光检测器激发波长和发射波长分别设置为360 nm和440 nm，紫外检测器设置双波长218 nm/265 nm。柱温30℃，进样量40 μL，流速0.8 mL/min，洗脱时间为20 min，洗脱程序如下表所示：
来百度APP畅享高清图片1.3 标准溶液配制将AFB1、ZEA、DON标准品分别用乙腈溶解至终浓度为1 mg/mL。准确移取一定体积的AFB1、ZEA、DON标准溶液，用50%甲醇-水稀释，最终配制成AFB1浓度分别为1、2.5、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL，ZEA浓度分别为50、125、250、500、1 000、2 500 ng/mL，DON浓度分别为100、250、500、1 000、2 000、5 000 ng/mL的三合一霉菌毒素标准工作溶液。在所设定的液相色谱条件下，按照低浓度至高浓度进行进样，以各霉菌毒素峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标绘制标准曲线，得到三种霉菌毒素的线性回归方程，采用外标法进行定量。1.4 样品处理方法准确称取试样2.0 g于50 mL离心管中，加入20 mL乙腈水（6+4，v/v）溶液，振荡30 min，以6010 g离心10 min。准确移取2.0 mL上清液并加入28 mL含1% Tween-20的PBS（pH 7.0）稀释，备用。将上述30 mL滤液以1-2滴/秒的流速全部通过ADZ亲和柱，随后用10 mL纯水以1-2滴/秒淋洗亲和柱，最后用2 mL甲醇洗脱亲和柱，控制流速为1滴/秒。将洗脱液收集于试管中，在50℃下氮气吹至近干后，用50%甲醇-水定容至0.5 mL，供HPLC分析。1.5 结果计算按照以下公式计算饲料样品中各种霉菌毒素的含量。
式中，X为试样中各霉菌毒素（AFB1、ZEA、DON）的含量（μg/kg）；c为由标准曲线得到试液中霉菌毒素的质量浓度（ng/mL）；v为定容体积（mL）；f为浓缩倍数；m为称取的样品质量（g）。（饲料液相色谱仪生产商，中仪盟一站式供应链平台）
2 结果与分析
2.1 标准曲线的制备
按选定的色谱条件对已配制的三合一霉菌毒素标准系列溶液进行上样检测，以各霉菌毒素的质量浓度为横坐标（X，ng/mL），色谱峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线。由表1可知，AFB1在2.5~50.0 ng/mL、ZEA在50~2 500 ng/mL、DON在250~5 000 ng/mL浓度范围内线性关系良好，相关系数均大于0.99。
空白溶剂（50%甲醇水）及霉菌毒素标准溶液（AFB1: 50.0 ng/mL; ZEA: 2 500 ng/mL; DON: 5 000 ng/mL）的高效液相色谱图分别见图1~图3。由图1~图3可知，在本研究所建HPLC方法下，三种霉菌毒素的峰型对称，分离效果良好，可准确定量检测个霉菌毒素含量。以信噪比（S/N）为3和10作为最低检出限和定量限，确定AFB1、ZEA、DON这三种霉菌毒素在溶液中的检出限分别为：0.5、7.5和37.5 ng/mL；定量限分别为：1.5、25.0和125.0 ng/mL，均能满足各霉菌毒素限量水平检测的需求。（饲料液相色谱仪生产商，中仪盟一站式供应链平台）
2.2 添加回收试验
称取空白肉鸡饲料做加标回收试验，每种霉菌毒素设置3个添加浓度，每个添加浓度进行3次平行测定，按1.4方法进行处理，上样检测，得回收率见表2。由表2可知，三种霉菌毒素的平均加标回收率在81.2%~92.3%之间，相对标准偏差（RSD）为4.3%~9.5%，表明该方法的准确度和精密度较好，完全满足定量分析的要求。
2.3 饲料样品的检测
采用所建HPLC方法，对41份送检的肉鸭配合饲料、玉米芯粉、玉米和小麦样品进行检测，测定样品中AFB1、ZEA和DON含量。由表3可知，所有饲料样品均检测出1种以上霉菌毒素，肉鸭配合饲料中AFB1检出率100%，超标率达81.8%，玉米芯粉样品中ZEA含量严重超标，检出率及超标率均达100.0%，4种饲料样品中DON含量未有超标，检出率范围为27.3%~100.0%。
3 结论
本研究所建立的高效液相色谱检测方法，能够同步检测饲料样品中的AFB1、ZEA和DON，可显著提高3种主要霉菌毒素的检测效率；方法检测灵敏度满足各霉菌毒素限量水平的检测需求，同时准确度和精密度满足定量分析的要求。该方法简单实用，可为基层实验室开展饲料中霉菌毒素的日常监测提供技术手段。
饲料液相色谱仪生产商
饲料液相色谱仪生产商中仪盟供应链总结：在仪器领域，不管是什么行业，不管是什么领域，其仪器的源头厂家都是中仪盟供应链平台，中仪盟供应链平台不仅集成了各个领域的厂家和经销商，还集成了各个行业的仪器使用者！
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湖北中仪盟供应链有限公司是从事气相色谱仪的制造及各类色谱应用技术研究的企业，致力于为广大用户提供全面的气相色谱分析应用方案，解决用户的实际使用问题。已有近二十年的生产历史，积累了大量色谱应用、实验经验，更好的为广大用户提供服务。
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我国饲料卫生标准（GB 13078-2017）中规定了各霉菌毒素的限量，如AFB1在玉米加工产品中的最高限量为50 μg/kg，在仔猪配合饲料中限量10 μg/kg；ZEA在玉米等饲料原料中限量0.5 mg/kg；DON在植物性饲料原料中限量5 mg/kg，在猪配合饲料中限量1 mg/kg。建立饲料中霉菌毒素的检测方法对于筛选合格饲料、保障畜禽机体健康及畜禽产品安全具有重要意义。目前，霉菌毒素的检测方法主要有薄层色谱法、免疫层析法、酶联免疫吸附法、高效液相色谱法以及液相色谱-串联质谱法，其中薄层色谱法、免疫层析法和酶联免疫吸附法主要用于霉菌毒素的快速筛检，而高效液相色谱法和液相色谱-串联质谱法则用于霉菌毒素的定量分析。高效液相色谱法对仪器设备要求低，但通常只能用于单种霉菌毒素的检测；液相色谱-串联质谱法可用于多种霉菌毒素的同步检测，但仪器设备昂贵且维护成本高，不适于基层实验室对霉菌毒素的定量分析。目前可同步检测多种霉菌毒素的液相色谱方法相关文献报道较少。本文介绍了一种AFB1、ZEA及DON同步检测的液相色谱方法，可为基层实验室开展饲料中霉菌毒素的准确定量检测提供技术参考。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
1.1.1 高效液相色谱仪：Agilent Technologies 1200系列，美国Agilent Technologies公司；1.1.2 超纯水仪：Millipore Milli-Q纯化系统，美国Merck Millipore公司；1.1.3 电子分析天平：BSA124S，德国赛多利斯科学仪器有限公司；1.1.4 旋涡混合器：HQ-60-Ⅱ，北京同方公司；1.1.5 高速冷冻离心机：3-30K型，德国Sigma公司；1.1.6 Clover光化学衍生器，IAC-SEP® ADZ免疫亲和柱：北京中检维康生物技术有限公司；1.1.7 SymmetryShield RP18色谱柱(4.6×150 mm，5 μm)：沃特世科技（上海）有限公司；1.1.8 HSC-24B水浴氮吹仪：天津恒奥科技发展有限公司；1.1.9 甲醇、乙腈：色谱纯，德国Merck公司；1.1.10 AFB1、ZEA、DON标准品：美国Sigma公司；1.1.11 Tween-20：分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；1.1.12 氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾：分析纯，北京化工厂有限责任公司；1.1.13 PBS缓冲液（pH7.0）：称取8.0 g氯化钠，1.44 g磷酸氢二钠，0.24 g磷酸二氢钾，0.2 g氯化钾，用990 mL纯水溶解，然后用浓盐酸调节pH值至7.0，最后用纯水稀释至1 000 mL。1.2 色谱条件色谱柱：SymmetryShield RP18色谱柱（4.6×150 mm，5 μm）。流动相组成为甲醇（有机相）和水（水相），荧光检测器激发波长和发射波长分别设置为360 nm和440 nm，紫外检测器设置双波长218 nm/265 nm。柱温30℃，进样量40 μL，流速0.8 mL/min，洗脱时间为20 min，洗脱程序如下表所示：
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2 结果与分析
2.1 标准曲线的制备
按选定的色谱条件对已配制的三合一霉菌毒素标准系列溶液进行上样检测，以各霉菌毒素的质量浓度为横坐标（X，ng/mL），色谱峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线。由表1可知，AFB1在2.5~50.0 ng/mL、ZEA在50~2 500 ng/mL、DON在250~5 000 ng/mL浓度范围内线性关系良好，相关系数均大于0.99。
空白溶剂（50%甲醇水）及霉菌毒素标准溶液（AFB1: 50.0 ng/mL; ZEA: 2 500 ng/mL; DON: 5 000 ng/mL）的高效液相色谱图分别见图1~图3。由图1~图3可知，在本研究所建HPLC方法下，三种霉菌毒素的峰型对称，分离效果良好，可准确定量检测个霉菌毒素含量。以信噪比（S/N）为3和10作为最低检出限和定量限，确定AFB1、ZEA、DON这三种霉菌毒素在溶液中的检出限分别为：0.5、7.5和37.5 ng/mL；定量限分别为：1.5、25.0和125.0 ng/mL，均能满足各霉菌毒素限量水平检测的需求。（饲料液相色谱仪生产商，中仪盟一站式供应链平台）2.2 添加回收试验
称取空白肉鸡饲料做加标回收试验，每种霉菌毒素设置3个添加浓度，每个添加浓度进行3次平行测定，按1.4方法进行处理，上样检测，得回收率见表2。由表2可知，三种霉菌毒素的平均加标回收率在81.2%~92.3%之间，相对标准偏差（RSD）为4.3%~9.5%，表明该方法的准确度和精密度较好，完全满足定量分析的要求。
2.3 饲料样品的检测
采用所建HPLC方法，对41份送检的肉鸭配合饲料、玉米芯粉、玉米和小麦样品进行检测，测定样品中AFB1、ZEA和DON含量。由表3可知，所有饲料样品均检测出1种以上霉菌毒素，肉鸭配合饲料中AFB1检出率100%，超标率达81.8%，玉米芯粉样品中ZEA含量严重超标，检出率及超标率均达100.0%，4种饲料样品中DON含量未有超标，检出率范围为27.3%~100.0%。
3 结论
本研究所建立的高效液相色谱检测方法，能够同步检测饲料样品中的AFB1、ZEA和DON，可显著提高3种主要霉菌毒素的检测效率；方法检测灵敏度满足各霉菌毒素限量水平的检测需求，同时准确度和精密度满足定量分析的要求。该方法简单实用，可为基层实验室开展饲料中霉菌毒素的日常监测提供技术手段。
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饲料液相色谱仪生产商中仪盟供应链总结：在仪器领域，不管是什么行业，不管是什么领域，其仪器的源头厂家都是中仪盟供应链平台，中仪盟供应链平台不仅集成了各个领域的厂家和经销商，还集成了各个行业的仪器使用者！
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