一、实验步骤
1.细胞固定： 首先检查细胞的传代情况。打开含有预置细胞爬片的细胞培养板，在每个孔中滴加适量组织固定液，固定细胞15分钟。之后，用超纯水洗涤孔板3到4次，去除固定液残留，确保细胞的洁净。
2.细胞破膜：使用组化笔在细胞分布均匀的区域画圈，以防止抗体流失。随后加入3毫升破膜液，室温下孵育20分钟。破膜后，用PBS缓冲液洗涤三次，每次5分钟，彻底去除破膜液。
3.血清封闭：在标记的圈内均匀滴加由牛血清蛋白配制的3% BSA溶液，充分覆盖细胞区域，室温封闭30分钟。若一抗来源于山羊，建议采用驴血清进行封闭；其他来源则可继续使用BSA封闭液。
4.一抗处理： 小心去除孔中的封闭液，然后加入一抗工作液。将细胞孔板平置于湿盒中，置于4℃环境中孵育过夜，以确保抗体的充分结合。
5.二抗处理：将孔板置于水平摇床上，轻轻晃动，洗涤三次，每次5分钟，随后甩干孔中的液体。在圈内滴加与一抗相对种属的二抗，并室温孵育50分钟以便充分结合。
6.DAPI复染细胞核：用PBS缓冲液再次清洗孔板三次，每次5分钟，甩干后在圈内滴加即用型DAPI染液，完全覆盖组织，并在室温下避光孵育10分钟。染色完成后，用PBS缓冲液洗涤三次，每次5分钟。
7.封片：在爬片上加入适量的酒精，将爬片轻轻撬起，使其倚靠孔的边缘。吸净多余酒精后，将爬片放入65℃烘箱中烘干15分钟。烘干后，从烤箱中取出孔板，在载玻片上做好相应标记。然后，在载玻片上滴加中性树胶，使用镊子夹起标记的爬片，并使细胞面朝下封片。确保整个封片过程无气泡产生，以避免影响显微观察效果。
二、注意事项
1.观察与保存：已完成封片的切片应尽快进行显微观察和拍照，以记录染色结果。为了保持荧光的稳定性，将切片置于4℃环境中避光保存。
2.准备工作：在使用组化笔画圈之前，建议用棉签轻轻拭去细胞爬片周围多余的液体。这有助于快速绘制形成疏水圈，提升圈画效果，并确保样品周围的试剂不会扩散。
3.异源免疫荧光实验：当进行异源免疫荧光实验时，务必选择不同种属来源的一抗，以减少交叉反应的风险。同时，所选择的荧光标记二抗需与一抗的种属相匹配，以确保特异性结合并避免非特异性染色。
4.避光操作：从开始孵育二抗时起，所有实验步骤应在避光条件下进行，尤其要避免紫外光直接照射。荧光染料在紫外线下易于淬灭，这可能导致假阴性结果，影响结果准确性。
5.操作细节：在洗涤过程中，需小心轻柔，以防损坏或吹落珍贵的细胞样本。通过细致谨慎的操作，可以确保实验的成功和结果的可靠性。
1.细胞固定： 首先检查细胞的传代情况。打开含有预置细胞爬片的细胞培养板，在每个孔中滴加适量组织固定液，固定细胞15分钟。之后，用超纯水洗涤孔板3到4次，去除固定液残留，确保细胞的洁净。
2.细胞破膜：使用组化笔在细胞分布均匀的区域画圈，以防止抗体流失。随后加入3毫升破膜液，室温下孵育20分钟。破膜后，用PBS缓冲液洗涤三次，每次5分钟，彻底去除破膜液。
3.血清封闭：在标记的圈内均匀滴加由牛血清蛋白配制的3% BSA溶液，充分覆盖细胞区域，室温封闭30分钟。若一抗来源于山羊，建议采用驴血清进行封闭；其他来源则可继续使用BSA封闭液。
4.一抗处理： 小心去除孔中的封闭液，然后加入一抗工作液。将细胞孔板平置于湿盒中，置于4℃环境中孵育过夜，以确保抗体的充分结合。
5.二抗处理：将孔板置于水平摇床上，轻轻晃动，洗涤三次，每次5分钟，随后甩干孔中的液体。在圈内滴加与一抗相对种属的二抗，并室温孵育50分钟以便充分结合。
6.DAPI复染细胞核：用PBS缓冲液再次清洗孔板三次，每次5分钟，甩干后在圈内滴加即用型DAPI染液，完全覆盖组织，并在室温下避光孵育10分钟。染色完成后，用PBS缓冲液洗涤三次，每次5分钟。
7.封片：在爬片上加入适量的酒精，将爬片轻轻撬起，使其倚靠孔的边缘。吸净多余酒精后，将爬片放入65℃烘箱中烘干15分钟。烘干后，从烤箱中取出孔板，在载玻片上做好相应标记。然后，在载玻片上滴加中性树胶，使用镊子夹起标记的爬片，并使细胞面朝下封片。确保整个封片过程无气泡产生，以避免影响显微观察效果。
二、注意事项
1.观察与保存：已完成封片的切片应尽快进行显微观察和拍照，以记录染色结果。为了保持荧光的稳定性，将切片置于4℃环境中避光保存。
2.准备工作：在使用组化笔画圈之前，建议用棉签轻轻拭去细胞爬片周围多余的液体。这有助于快速绘制形成疏水圈，提升圈画效果，并确保样品周围的试剂不会扩散。
3.异源免疫荧光实验：当进行异源免疫荧光实验时，务必选择不同种属来源的一抗，以减少交叉反应的风险。同时，所选择的荧光标记二抗需与一抗的种属相匹配，以确保特异性结合并避免非特异性染色。
4.避光操作：从开始孵育二抗时起，所有实验步骤应在避光条件下进行，尤其要避免紫外光直接照射。荧光染料在紫外线下易于淬灭，这可能导致假阴性结果，影响结果准确性。
5.操作细节：在洗涤过程中，需小心轻柔，以防损坏或吹落珍贵的细胞样本。通过细致谨慎的操作，可以确保实验的成功和结果的可靠性。
