Keap1是小胶质细胞中USP7去泛素化的直接底物
第一步，筛选USP7底物蛋白
基于氨基酸的稳定同位素标记（SILAC）蛋白质组学，其中5种在EB处理后显著下调（图2a）。其中，Keap1在炎症过程发挥关键作用。因此，推测Keap1可能是USP7激活小胶质细胞的潜在底物蛋白。放线菌酮（CHX）细胞，发现EB依赖的Keap1降解明显加快（图2b）。
第二步，验证USP7与Keap1相互作用
Co-IP实验发现，USP7与Keap1相互作用（图2c）。免疫荧光分析显示EB通过促进USP7核转位来抑制USP7-keap1共定位（图2d）。USP7敲除消除了EB介导的Keap1降解（图2e），表明USP7是小胶质细胞中Keap1稳定性的关键决定因素。分别构建USP7和Keap1的截短体进行Co-IP实验，发现USP7的TRAF结构域促进了USP7-Keap1的相互作用（图2f）。
第三步，验证USP7直接去泛素化Keap1
体外泛素化实验显示，在Cul3， Rbx1, ubiquitin， E1和E2-UbcH5a的体外环境中，观察到keap1泛素化，而USP7可以抑制keap1泛素化，EB则显著增加了Keap1泛素化（图2g）。为研究usp7介导的Keap1去泛素化是由K48还是K63介导，进行Co-IP实验。发现在USP7敲低或EB处理后，Keap1的K63和k48连接的泛素化显著增加，表明USP7对Keap1的去泛素化具有位点非选择性（图2h）。蛋白酶体抑制剂MG132和自噬抑制剂Baf-A1处理细胞显示，EB促进Keap1降解，Baf-A1逆转了EB介导的Keap1降解，但对MG132没有逆转，表明Keap1降解是通过自噬依赖的方式进行调控的（图2i）。
综上所述，Keap1是USP7在小胶质细胞中的泛素化降解底物。
图2 Keap1是小胶质细胞中USP7去泛素化的直接底物（Ref. Fig 3）
全文分享可查阅：【《Adv Sci》解读：HuProt™蛋白芯片筛选中药单体下游靶点！野马追内酯靶向USP7抑制神经炎症，用于治疗神经退行性疾病】。
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