简介:
两个大分子间的共价结合,比如抗体与酶或者酶与DNA,是研究人员一项重要的任务。有几种方法可用于交联两种生物大分子。常用的一种方法是使用小型交连剂(如磺化-SMCC)。SMCC的一端有一个胺反应性NHS酯基团,可与蛋白质上的自由胺(-NH2)发生反应;另一端有一个硫基反应性的马来酰基团,可与待连接生物大分子上的硫基(-SH)发生反应。由于蛋白质通常包含自由胺和硫基两种官能团,SMCC修饰的连接剂极不稳定且容易自反应,导致大量同型交联反应。此外,定量检测蛋白质上马来酰基团的数目也很复杂,确定两种生物大分子在反应中的适当摩尔比以便获得理想的功能和偶联效率也比较困难。
我们开发出了一种方便有效的交联方法,可用这种方法高效率地交联两个生物大分子。这种方法使用两种独特的交联剂(Buccutite MTA和Buccutite FOL)。 蛋白质上MTA和FOL交联剂的控制和定量都非常容易。经过脱盐柱去除未反应的交联剂后,Buccutite MTA活化的抗体和Buccutite FOL修饰的蛋白质在温和条件下混合即可反应。这种方法基本无需纯化,在反应中也不会发生各生物分子间的同型交联。
使用Buccutite MAT和Buccutite FOL的交联方法
材料和方法:
抗体和酶:山羊抗小鼠lgG和小鼠lgG来自Jacksonm免疫研究实验室,HRP来自Calzyme,微管蛋白小鼠mAb来自Life Technologies.
纯化柱:所有纯化柱都来自Bio-Rad公司的Bio-Spi凝胶过滤柱。
细胞成像:HeLa细胞固定于4%甲醛,并用小鼠抗微管蛋白进行染色,然后用HRP-山羊抗小鼠IgG二抗进行染色。图像采用Olympus IX71荧光显微镜拍摄得到。
共轭原理:
1. 用MAT激活山羊抗小鼠lgG,用FOL(1小时)修饰标签蛋白(APC或PE)。
2. 用旋转柱(5min)对激活的lgG5和修饰的标记蛋白进行纯化。
3. 将活化的抗体和修饰的标记蛋白混合30分钟。
用所需的缀合物染色细胞,无需纯化。
抗体蛋白质结合过程
结果:
用于ELISA检测的HRP-lgG偶联物
用BuccutiteAM交联技术(红色)和SMCC方法(蓝色)制备HPR-山羊-抗小鼠lgG偶联物,产生直接ELISA曲线。将小鼠单克隆抗体(100ng)包被在96孔板上,用标准方法将GAM lgG-HRP偶联物稀释为2倍稀释系列。使用ABTS底物溶液(#11001)检测30分钟并在405nm读取的固定化小鼠lgG.
用于细胞成像的lgG-RPE缀合物
在Hela细胞中用RPE-山羊-抗小鼠lgG偶联物对微管蛋白进行成像。使用小鼠抗α-微管蛋白抗体对微管蛋白进行染色,并如上所述用Buccutite交联技术制备的红色荧光RPE-山羊-抗小鼠lgG缀合物进行可视化。
结论:
1.Buccutite 交联系统非常稳定。经Buccutite 交联剂活化的大分子非常稳定,可以在4°C条件下长达24个月以上保存。
2.缀合条件非常温和且稳定。Buccutite结合物可以在PH、浓度和温度范围内运行,不需要催化剂。
3.高效率:Buccutite共轭可在1小时内完成。在相同条件下,Buccutite共轭法比其他现有的方法具有更高的产率,共轭可以在极低的浓度下进行。
两个大分子间的共价结合,比如抗体与酶或者酶与DNA,是研究人员一项重要的任务。有几种方法可用于交联两种生物大分子。常用的一种方法是使用小型交连剂(如磺化-SMCC)。SMCC的一端有一个胺反应性NHS酯基团,可与蛋白质上的自由胺(-NH2)发生反应;另一端有一个硫基反应性的马来酰基团,可与待连接生物大分子上的硫基(-SH)发生反应。由于蛋白质通常包含自由胺和硫基两种官能团,SMCC修饰的连接剂极不稳定且容易自反应,导致大量同型交联反应。此外,定量检测蛋白质上马来酰基团的数目也很复杂,确定两种生物大分子在反应中的适当摩尔比以便获得理想的功能和偶联效率也比较困难。
我们开发出了一种方便有效的交联方法,可用这种方法高效率地交联两个生物大分子。这种方法使用两种独特的交联剂(Buccutite MTA和Buccutite FOL)。 蛋白质上MTA和FOL交联剂的控制和定量都非常容易。经过脱盐柱去除未反应的交联剂后,Buccutite MTA活化的抗体和Buccutite FOL修饰的蛋白质在温和条件下混合即可反应。这种方法基本无需纯化,在反应中也不会发生各生物分子间的同型交联。
使用Buccutite MAT和Buccutite FOL的交联方法
材料和方法:
抗体和酶:山羊抗小鼠lgG和小鼠lgG来自Jacksonm免疫研究实验室,HRP来自Calzyme,微管蛋白小鼠mAb来自Life Technologies.
纯化柱:所有纯化柱都来自Bio-Rad公司的Bio-Spi凝胶过滤柱。
细胞成像:HeLa细胞固定于4%甲醛,并用小鼠抗微管蛋白进行染色,然后用HRP-山羊抗小鼠IgG二抗进行染色。图像采用Olympus IX71荧光显微镜拍摄得到。
共轭原理:
1. 用MAT激活山羊抗小鼠lgG,用FOL(1小时)修饰标签蛋白(APC或PE)。
2. 用旋转柱(5min)对激活的lgG5和修饰的标记蛋白进行纯化。
3. 将活化的抗体和修饰的标记蛋白混合30分钟。
用所需的缀合物染色细胞,无需纯化。
抗体蛋白质结合过程
结果:
用于ELISA检测的HRP-lgG偶联物
用BuccutiteAM交联技术(红色)和SMCC方法(蓝色)制备HPR-山羊-抗小鼠lgG偶联物,产生直接ELISA曲线。将小鼠单克隆抗体(100ng)包被在96孔板上,用标准方法将GAM lgG-HRP偶联物稀释为2倍稀释系列。使用ABTS底物溶液(#11001)检测30分钟并在405nm读取的固定化小鼠lgG.
用于细胞成像的lgG-RPE缀合物
在Hela细胞中用RPE-山羊-抗小鼠lgG偶联物对微管蛋白进行成像。使用小鼠抗α-微管蛋白抗体对微管蛋白进行染色,并如上所述用Buccutite交联技术制备的红色荧光RPE-山羊-抗小鼠lgG缀合物进行可视化。
结论:
1.Buccutite 交联系统非常稳定。经Buccutite 交联剂活化的大分子非常稳定,可以在4°C条件下长达24个月以上保存。
2.缀合条件非常温和且稳定。Buccutite结合物可以在PH、浓度和温度范围内运行,不需要催化剂。
3.高效率:Buccutite共轭可在1小时内完成。在相同条件下,Buccutite共轭法比其他现有的方法具有更高的产率,共轭可以在极低的浓度下进行。